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研究背景与目的血管内皮增长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)在肿瘤血管生成中的作用早已明确,并且是肿瘤血管生成因子(tumor-angiogenesis factor,TAF)中作用最强的一种,在肿瘤生长、浸润和转移等方面有重要作用。目前,抗血管生成已成为肿瘤生物治疗研究的热点。SHH信号通路在胚胎发育和血管生成中起着关键性的作用,但在正常成人中却很少表达。已有研究发现在眼部病理性血管形成时,阻断SHH信号通路,血管生成明显减少,同时,可下调VEGF的表达。近年来的研究表明,多种肿瘤组织中存在SHH信号通路的异常激活。已有临床数据证实肿瘤组织中SHH信号通路与VEGF的表达存在相关性,但二者的具体作用机制尚未见报道。那么,在肿瘤组织中,VEGF是否为该通路的下游靶基因,能否通过抑制SHH信号通路而降低肿瘤中VEGF的表达,从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。研究方法1.荧光定量PCR检测VEGF基因表达标准品质粒构建及标准曲线的建立。设计VEGF基因的特异性引物,以肝癌Hep3B细胞mRNA为模板进行扩增,将扩增的基因片段克隆到T载体PMD19-T上,构建标准品质粒,PCR及测序鉴定。以此标准品质粒为模板,倍比稀释,SYBR GREEN实时定量PCR检测基因拷贝数,并确立标准曲线,建立荧光定量PCR(FQ-PCR)的检测方法。2. Cyclopamine特异性阻断肝癌细胞Hep3B中SHH通路后,检测VEGF mRNA表达量及VEGF蛋白表达量。将细胞分组培养,处于70%—80%融合状态时,实验组加cyclopamine处理。提取各实验组mRNA及蛋白,分别用FQ-PCR及Western blot检测VEGF基因水平及蛋白水平的表达。3.使用针对SHH信号通路中的核转录因子Gli1的干扰质粒pGenesill-Gli1转染肝癌细胞Hep3B,检测VEGF表达量。4.联合siRNA干扰与小分子抑制剂cyclopamine共同作用后,检测VEG表达量,检测方法同上。研究结果1. PCR及测序结果证实标准品质粒构建成功,实时荧光定量PCR扩增峰单一,解链温度均一,提示扩增产物特异,当模板拷贝数在102-107之间时与Ct值呈良好的线性关系,经荧光定量PCR仪自动分析得到标准曲线,荧光定量PCR检测VEGF mRNA方法成功建立。2经cyclopamine处理后的肝癌细胞Hep3B中,VEGF在基因水平及蛋白水平表达量均较对照组下降,同样,干扰Gli1后,VEGF表达量也呈下降趋势,而采用小分子抑制剂和RNA干扰共同作用后,VEGF表达量下降更明显。研究结论建立的荧光定量PCR的检测方法为后续实验提供了一种快速、准确检测样本中VEGF mRNA的拷贝数的方法。肝癌细胞Hep3B中VEGF的表达量受SHH信号通路调控,VEGF为该信号通路的下游靶基因,且处于Gli1的下游。联合外源性药物抑制及siRNA干扰共同作用于SHH信号通路对VEGF表达调控的作用明显增强。通过抑制SHH信号通路而下调VEGF的表达可望成为抗血管治疗肿瘤的又一新的思路。