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凝乳酶是奶酪工业化生产的关键酶制剂,目前主要从动物组织提取获得,酶源严重不足。尽管研究已发现多种动物和植物均含有凝乳酶,但相比之下,以微生物发酵法生产较从动植物中提取更具有显著优势,是解决该酶制剂来源,降低成本的有效途径。为此,自20世纪90年代以来,国外利用生物工程技术生产凝乳酶的研究广泛开展,而国内在这方面研究尚较为匮缺,报道不多。为推进微生物发酵法生产凝乳酶的进程,本研究首先开展了野生型高产凝乳酶的微生物菌株的筛选,得到3株国内外至今尚未报道的,产凝乳酶的气单胞菌(Aeromonas spp)新菌株C31、C41和C42,不过,鉴于这些菌株均为人类致病菌,不适合用于生产凝乳酶制剂。基于牛凝乳酶已被广泛用于奶酪生产,进一步从GenBank数据库获取该酶的基因序列,根据牛凝乳酶的原酶与活性酶之间的氨基酸序列差异及表达系统对密码子的偏好性对基因片段进行优化,合成该基因,利用巨大芽孢杆菌表达系统,构建该基因的表达载体pHIS1525-RC,以木糖为诱导物,将表达载体转化原生质体进行表达。经PCR、双酶切、蛋白质SDS-PAGE电泳和酶活力检测等方法验证,本研究在国内外首次利用巨大芽孢杆菌表达系统成功表达具有生物活性的牛凝乳酶基因(NO.180994)。利用Ni-NTA层析对表达酶进行分离纯化,分析其酶学性质,结果表明,所表达的牛凝乳酶与天然酶的酶学性质几乎完全相同,分子量为35.6kDa,最适作用温度为45℃,20℃-50℃下具有较好的热稳定性,保温30min尚保持75%以上酶活,70℃处理30min酶活几乎完全丧失。最适作用pH为5.0,pH4.6～5.8下酶活保持80%以上,在pH3.0～7.4范围内酶活比较稳定,在低于pH3.0或高于pH7.4活性迅速降低。进一步优化重组菌株WH320-RC的产酶培养条件,结果显示最适碳源为果糖,葡萄糖对产酶强烈抑制,最适氮源为酵母粉和牛肉膏,最适培养温度为37℃,最适培养pH为7.0,0.5%的木糖对酶表达的诱导效果最好,浓度过高或过低均不利用诱导,培养基添加0.2%的吐温-80可使产酶量提高30%。将所合成的基因成功构建大肠杆菌表达载体pET-22b-RC和pQE30-RC,但在大肠杆菌表达系统[BL21(DE3)和M15菌株]未能有效表达,这可能是巨大芽孢杆菌和大肠杆菌二个表达载体对密码子的偏好性不同所致,有待进一步研究。本研究通过对牛凝乳酶基因的序列进行优化、合成,利用巨大芽孢杆菌表达系统WH320成功实现了活力表达,得到了具有凝乳酶活性的表达产品,为我国生物工程技术的方法自主生产凝乳酶提供了基础。