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随着现代社会的发展,石油、煤炭等非可再生资源逐渐枯竭,人们所面临的能源危机和环境污染问题越来越严重,因此开发利用清洁、环境友好型能源已经成为人们的迫切需求。以纤维素为主要成分的植物生物质是地球上最丰富的可再生资源,人们对于纤维素的开发利用越来越受到重视,但是由于纤维素结构致密且存在结晶区使其不容易被酶解,纤维素的有效利用还存在很多障碍,因此阐明自然界中高效的纤维素降解机制,提高结晶纤维素的降解效率是木质纤维素利用的关键。自然界中存在多种降解纤维素的微生物,它们采取不同的策略和机制对纤维素进行有效降解。好氧的哈氏噬纤维细菌（Cytophaga hutchinsonii）广泛分布于自然界中,能够高效、快速、彻底的降解结晶纤维素。C. hutchinsonii既不像真菌一样分泌游离的纤维素酶系,也不含有厌氧细菌的纤维小体,暗示着其采取了一种新型的纤维素降解策略,以实现对纤维素的有效降解。因此,对C.hutchinsonii纤维素降解机制的研究和阐明能够丰富和提高人们对于纤维素降解机理的认识,促进纤维素的开发和利用。本文以C. hutchinsonii为研究对象,对其与纤维素降解相关基因进行鉴定和功能研究。一方面通过转座子随机插入构建突变体库的方法筛选获得纤维素利用缺陷突变株。我们获得了一株纤维素利用缺陷突变株MTl-5,并对其插入失活的基因进行了鉴定和功能研究。另一方面,对可能与纤维素降解相关的基因cbp1（chu3654）和oppA （chu3498）进行单插入失活,研究它们的失活对菌株利用纤维素能力的影响。具体研究内容和结果如下：1. C. hutchinsonii纤维素利用缺陷突变株MTl-5的筛选与鉴定通过将转座子pHimarEml随机插入到野生型菌株基因组中,得到大量的突变株,经过筛选,我们获得一株不能以纤维素和滤纸分别为唯一碳源生长的缺陷突变株MTl-5。经鉴定突变株MTl-5中基因chu2981被插入失活。基因chu2981的开放阅读框含有393个核苷酸,编码蛋白仅由130个氨基酸组成,将其命名为Spplo序列分析表明Sppl是一个未知功能的保守蛋白。2. C. hutchinsonii纤维素降解相关基因sppl （chu2981）基因功能的研究筛选到的突变株MTl-5在以葡萄糖、纤维二糖分别为唯一碳源的培养基中培养时,与野生型菌株生长状况无明显差异,但在以纤维素作为唯一碳源的培养基中丧失了生长能力。MT1-5中参与纤维素吸附的外膜蛋白的种类和数量也极大降低。此外,MTl-5在琼脂平板上的扩散能力和在玻璃表面的运动能力也明显下降。对突变株进行基因回补,回补菌株能够恢复纤维素利用能力、在琼脂平板上的扩散能力和液体中的运动能力。上述结果表明,突变株MTl-5中缺失的Sppl蛋白在菌株利用纤维素和扩散、运动过程中发挥着极其重要的作用。Western blot检测发现Sppl定位于细胞的周质空间,其功能和作用机制需要进一步研究。3.周质空间蛋白Sppl的异源表达、纯化及功能研究在大肠杆菌中对Spp1进行异源表达和纯化,得到N端带有GST标签的重组蛋白GST-Spp1。在体外添加重组蛋白GST-Spp1不能恢复突变体对纤维素的利用。采用’GST pull-down"方法没有钓取到C. hutchinsonii中与GST-Spp1相互作用的蛋白。检测发现重组蛋白GST-Spp1在缓冲液中是以单体形式存在的。4. C. hutchinsonii可能的纤维素降解相关基因cbp1（chu3654）和oppA （chu3498）的插入失活及功能研究对编码可能的纤维素吸附蛋白的基因cbpl （chu3654）和可能的纤维二糖结合蛋白的基因oppA （chu3498）进行单插入失活。Cbp1的失活导致菌株吸附纤维素的外膜蛋白的总量降低,但并未显著影响菌体的纤维素利用能力和菌体对纤维素的吸附能力。OppA的失活导致菌株的纤维二糖利用能力受到较大影响,但也未显著影响菌体对于纤维素的利用能力。上述结果表明,Cbpl和OppA的缺失对Cytophaga hutchinsonii的纤维素利用能力均并未有显著影响,对菌株纤维素利用过程中的重要基因仍需进一步探索研究。