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目的:探讨PKCα在TOCP影响SK-N-SH神经细胞自噬的作用及机制。方法:1.SK-N-SH细胞经TOCP(0~1 mmol/L)染毒,通过MTT法测定该化合物对细胞增殖的影响,并利用SPSS软件算出SK-N-SH细胞暴露于TOCP(48 h)的半数抑制浓度(IC50),并确定后期实验的染毒剂量。2.SK-N-SH细胞经TOCP(0~1 mmol/L)染毒,通过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、pPKCα蛋白、自噬蛋白(P62、Beclin 1、LC3II/LC3I)、自噬受体蛋白(OPTN、NBR1)、细胞骨架蛋白(p-Tau、NF-H、MAP2)和泛素化蛋白(Ub)表达水平。使用了透射电子显微镜观察自噬体的生成情况。3.SK-N-SH细胞经PKCα激活剂(PMA)和抑制剂(SP)预处理0.5 h后,0.75 mmol/L TOCP染毒48 h,过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、p-PKCα蛋白、自噬蛋白(P62、Beclin 1、LC3II/LC3I)、自噬受体蛋白(OPTN、NBR1)、细胞骨架蛋白(p-Tau、NF-H、MAP2)和泛素化蛋白(Ub)表达水平。免疫荧光法测定PKCα蛋白和自噬相关蛋白(LC3和P62)的蛋白表达水平来进一步验证WB的结果;结果:1.MTT数据表明,当SK-N-SH细胞暴露于TOCP(48 h)后,细胞生长形态发生改变以及增殖速度显著减慢。2.SK-N-SH细胞暴露于TOCP(48 h)后,细胞内PKCα活性显著增加;用PKCα激活剂(PMA)和抑制剂(SP)预处理后再经TOCP染毒,发现激活剂能使TOCP所诱导的细胞内PKCα活性上升(P<0.05),相反,抑制剂能使细胞内PKCα活性下降(P<0.05)。WB结果显示,TOCP、PMA和PMA+TOCP三组细胞内PKCα活性(p-PKCα/PKCα)、自噬蛋白(LC3Ⅱ/LC3I和P62)水平增加(P<0.05);而SP和SP+TOCP两组细胞内PKCα活性(p-PKCα/PKCα)、自噬蛋白(LC3Ⅱ/LC3I和P62)水平(P<0.05)下降。免疫荧光法测定PKCα蛋白和自噬相关蛋白(LC3和P62)的蛋白表达水平进一步验证了WB的结果。3.TOCP处理能使细胞中OPTN和NF-H水平下降(P<0.05),P-Tau和NBR1水平上升(P<0.05),但MAP2水平无明显变化。TOCP、PMA和PMA+TOCP三组处理能够抑制细胞内蛋白酶体活性,泛素化蛋白(Ub)积累(P<0.05)。结论:1.TOCP能够使细胞内PKCα活性增加。2.TOCP通过激活PKCα活性,增加自噬蛋白(LC3II/LC3I、P62)表达水平,降解OPTN,并累积了NBR1蛋白,从而抑制细胞自噬流。3.TOCP通过激活PKCα活性降解骨架相关蛋白NF-H和p-Tau的累积。4.TOCP通过激活PKCα使SK-N-SH细胞中蛋白酶体(Proteasome)活性降低,泛素化蛋白积聚,使泛素-蛋白酶体系统(UPS)受损,UPS功能障碍可以刺激自噬作为补偿途径。