我国是农业生产和水产养殖大国,但是病原菌侵害和生产养殖过程中抗生素滥用等问题严重影响了这些行业的健康发展,造成重大经济损失和安全危害,寻找高效低毒、安全绿色的抗生素替代品在现阶段显得尤为重要。本研究从带鱼(Trichiutus haumela)肠道样品中筛选分离到一株能够抗多种水产病原细菌和植物病原真菌的暹罗芽孢杆菌JFL15,对其所产的抗菌物质的分子结构、抗菌机理及其生物合成途径进行了深入研究,为该菌株的进一步开发和应用提供理论基础和技术支持。所得主要研究结果与结论如下:(1)采用形态学、生理生化和16S rDNA的分子生物学等方法,对菌株JFL15进行了分类学鉴定,确定其为暹罗芽孢杆菌,并将其命名为暹罗芽孢杆菌JFL15(Bacillus siamensis JFL15)。(2)对B.siamensis JFL15发酵产抗菌物质的培养基和培养条件进行了优化,确定最终的培养条件为:最佳培养基为无机盐矿物培养基(MSM培养基),最佳培养条件为:装液量100 mL、接种量1%、培养基自然pH(7.2)、培养温度30°C、培养时间72 h、转速200 rpm。同时,对菌株JFL15的发酵上清液的理化性质和抗菌物质的提取方法进行了初步研究,结果表明,发酵上清液中的抗菌活性物质对酶、温度、酸碱度、紫外线都很稳定,并且在4°C下储存28天后还能保持较高的活性;硫酸铵沉淀、盐酸沉淀甲醇抽提和乙酸乙酯萃取3种方法提取的粗提物对15株水产病原菌和5株植物病原真菌均具有较强的抑制活性。(3)对B.siamensis JFL15的抗菌物质进行纯化和鉴定,共鉴定出包括挥发性抗菌物质(酮类、碳氢化合物、醇类、酯类等)及脂肽类(surfactin、fengycin、iturin A、bacillomycin F)、嗜铁素类(bacillibactin)、聚酮类和环二肽类等多种抗菌物质,且各类化合物中都含有多种同系物。(4)研究了化合物iturin A和bacillomycin F的最小抑菌浓度(MIC)和抗菌机理,结果显示,iturin A和bacillomycin F对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、芒果炭疽病菌、荔枝霜疫霉菌和荔枝炭疽病菌的MIC分别为62.50、31.25、62.50、31.25、62.50和125.00、62.50、125.00、62.50、125.00μg/mL。扫描电镜的结果表明,对照组的菌丝生长正常,呈现出完整光滑的菌丝表面和饱满的管状结构。而经iturin A或bacillomycin F处理的菌丝被破坏,表现为菌丝变形和畸形,其表面粗糙、褶皱和不规则。(5)对暹罗芽孢杆菌JFL15进行了全基因组测序。结果显示,B.siamensis JFL15基因组大小为3,841,225 bp,共有5条Scaffolds,G+C含量为46.35%。基因组中包含3933个基因,编码序列占整个染色体序列的88.52%,3933个基因中有3600个蛋白质编码基因(CDS);另外还含有25个rRNA、82个tRNA和9个sRNA和123个串联重复区域。同时,对B.siamensis JFL15基因组进行了全面的特征功能和代谢分析,包括COG、GO和KEGG等。(6)利用antiSMASH软件对B.siamensis JFL15次级代谢产物的基因簇进行预测,共预测出至少9种抗菌物质合成基因簇,包括脂肽类(surfactin、fengycin)、聚酮类(difficidin、bacillaene)、嗜铁素类(bacillibactin)、氨基糖苷类抗菌物质(plantazolicin、butirosin)、羊毛硫细菌素(lantipeptide)和一个新型的聚酮化合物基因簇(PKS)等,同时对这些抗菌物质的代谢途径和调控因子进行了初步分析。(7)利用生物信息学手段从暹罗芽孢杆菌JFL15基因组中成功挖掘了C、G、T、S、A2、N、AP和B1等8个抗菌蛋白基因,同时对这8个基因进行了原核异源表达和抗菌活性检测,结果显示,8个蛋白均获得成功表达,重组蛋白C、G、T和AP对荔枝炭疽病菌有较微弱的抗菌活性,而重组蛋白S、A2、N和B1则无抗菌活性。(8)构建了暹罗芽孢杆菌的遗传转化体系,确定最佳条件为:感受态制备时添加1%DL-苏氨酸、2%甘氨酸、0.1%色氨酸和0.03%吐温80,电击缓冲液中不含盐离子,只含0.5 M山梨醇、0.5 M甘露醇和0.5 M海藻糖,电转质粒浓度最好在600ng/μL以上,最佳电击参数为电压2.1 kv、电击时间5 ms、电容25 u F和电阻200Ω。(9)成功构建了以敲除cody基因为靶向的同源敲除质粒pHT08-cody-up-down和基于CRISPR-Cas9的基因敲除质粒pHT08-Cas9-gRNA,并都成功转入暹罗芽孢杆菌JFL15中,同时Cas9蛋白成功获得表达,但两种方法均未成功敲除cody基因。