抗虫基因载体的构建及白菜转基因研究

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蜘蛛杀虫蛋白(Spider insecticidal protein,SIP)基因可编码一种只有37个氨基酸的小肽,该多肽能杀死多种有害昆虫。质粒pBBBast-PinⅡ含有马铃薯蛋白酶抑制剂基因PinⅡ(Potato proteinase inhibitor Ⅱ),PinⅡ基因编码的蛋白酶抑制剂具有广谱抗虫性。实验以蜘蛛杀虫肽基因为目的基因,将其转入质粒pBBBast-PinⅡ中,从而构建含有PinⅡ和SIP两个抗虫基因的双价植物表达载体——pBBBast-PinⅡ-SIP。同时,还将SIP基因转入pBBBast中,构建单价抗虫载体pBBBast-SIP。经过限制性内切酶酶切以及PCR目的片段扩增证明两个载体构建正确。 通过真空渗入和花序浸渍法,将上述双抗和单抗基因分别导入白菜不结球类型——49菜心中,获得了7棵抗性株。通过对标记性状——除草剂抗性的活体及离体检验(氯酚红法)、目的基因PCR扩增、PCR-Southern杂交等方法证实目的基因已整合到小白菜基因组中。其中2棵抗性株自交后代的遗传分析表明,真空渗入法所得的转化株为杂合体,且其分离比符合3:1的单基因分离规律。 对小白菜真空渗入转化法的转化条件进行了初步探索。结果表明植株生长阶段和真空渗入处理时间,所用菌株类型均对转化率有影响。其中以开花初期的植株,利用胭脂碱型农杆菌介导(如C58),真空渗入5分钟的处理方法转化效率最高。
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