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目的：
观察脑出血后血肿周围脑组织炎症因子的动态变化以及不同时间点电针治疗对其的影响,全面了解多种炎症因子在ICH后的作用机制,探讨电针治疗急性脑出血后炎性免疫反应的可能的干预机制。
方法：
体重为200±20g的健康成年Wistar雄性大鼠,随机分为4大组:正常组、假手术组、模型对照组、电针治疗组,模型对照组分为5个时间点,即分为造模后6h、24h、48 h、72 h、8天五个小组;电针治疗组,即将电针治疗组分为6 h、24 h、48 h、72 h四个小组。正常组不做任何处理,假手术组造模时用生理盐水代替胶原酶Ⅶ进行造模,模型对照组和电针治疗组采用0.5u胶原酶Ⅶ注射大鼠尾壳核进行造模,确定造模成功后电针治疗组开始做治疗,分别于造模后相应的时间点开始针刺,取“水沟”、“百会”、“足三里”(双侧),接G6805-2型电针仪,疏密波,强度1mA,每次留针30min,每日电针一次,连续电针治疗5次。模型对照组不做治疗,在造模后的6 h、24 h、48 h、72 h、8天相应的时间点取材,电针治疗组分别在造模后相应时间开始做治疗,分别连续治疗5天后取材,进行相关指标的检测。应用干湿法检测血肿周围脑组织的含水量,用HE染色观察血肿周围组织形态学的变化,分别用免疫组化和western-blot检测ICAM、MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达。
结果：
(1)HE染色结果:正常组和假手术组可见丰富的神经细胞,排列整齐,核仁清晰。6h模型对照组大鼠尾状核血肿区可见大片出血灶及点状出血,红细胞浸润,神经细胞坏死,髓质可见部分片状间质轻度水肿;24h可见大量的空泡,中性粒细胞和淋巴细胞浸润现象,炎症反应明显;48h血肿周围脑组织水肿严重,可见大量小胶质细胞浸润和明显的炎性细胞浸润;72h脑组织内脑组织水肿和细胞间隙空化最为明显,周围可见较多和炎性细胞浸润;8天模型对照组血肿周围轻度水肿;6h电针治疗组脑组织内可见点状出血,细胞间质仍有轻度水肿,可见部分中性粒细胞浸润和胶质细胞;与6h模型对照组比较相似。24h电针治疗组脑组织内可见水肿明显减轻,坏死灶明显缩小、极少量出血,有一定的中性粒细胞浸润。48h电针治疗组,水肿明显减轻,可见少量见中性粒细胞浸润,72h电针治疗组可见水肿基本消失,与8天模型对照组比较有明显的好转。电针治疗能明显减轻炎症反应,减少炎症细胞的浸润。
(2)脑出血大鼠各时间点脑组织含水量的结果:6h模型对照组脑含水量有一定程度的增加,24 h组脑含水量明显增高,72 h时含水量达到高峰,在8天时逐渐下降,模型对照组与正常组和假手术组比较有显著性差异(P＜0.01),而相应时间点的电针治疗组与模型对照组比较:6h电针治疗组与6h模型对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05),与8天模型对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);其余相应时间点的电针治疗组与模型对照组比较有显著性的差异(P＜0.01),与8天模型对照组比较有显著性的统计学意义(P＜0.01)。除了6h电针治疗组,其余时间点进行电针治疗能明显减轻脑出血大鼠脑组织的含水量,减轻脑水肿。
(3)ICAM-1免疫组化和免疫印迹结果显示:模型对照组的各个时间点血肿周围组织均有不同程度ICAM-1阳性反应的内皮细胞和神经细胞,脑出血后6h周围血管和神经细胞均有ICAM-1的表达,24h、48h ICAM-1表达持续增加,72h达高峰,至8d仍有较高水平的表达。各电针治疗组与对应时间点的模型对照组ICAM-1的表达比较有显著性的差异(P＜0.01),6h电针治疗组与6h模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),但是作用却是增加了ICAM-1的表达,与8天组比较无统计学意义(P＞0.05);其余电针治疗组与对应时间点的模型对照组ICAM-1的表达比较有显著性的差异(P＜0.01),与8天组比较有显著性的差异(P＜0.05)。除了6h电针治疗组,其余时间点进行电针治疗能降低脑出血后大鼠脑组织中ICAM-1的表达。
(4)脑组织中MMP-9、TIMP-1表达结果显示:正常组未见明显的MMP-9、TIMP-1的表达,模型对照组6h可见MMP-9明显表达,24h表达逐渐增强,在48h组达到最高峰,在8天时有少量水平的低表达;模型对照组TIMP-1的表达与MMP-9各组的表达相似。经过电针治疗后,除6h电针治疗组外,电针治疗组各时间点MMP-9的表达较模型对照组的各时间点比较都有明显的减少,而TIMP-1表达较模型对照组各时间点比较都有明显的增加。统计学的比较:6h电针治疗组分别与6h模型对照组和8天模型对照组比较都无统计学意义(P＞0.05),而其余各电针治疗组与对应时间点的模型对照组的MMP-9、TIMP-1的表达比较,存在着显著性的差异(P＜0.01),24h、48h、72h组电针治疗组与8天模型对照组比较都有显著性的差异(P＜0.05),电针能降低脑出血大鼠血肿周围MMP-9和升高TIMP-1的表达。
(5)脑组织中MMP-2表达结果显示:正常组与假手术组MMP-2的表达无明显差别(P＞0.05),各模型对照组较假手术组和正常组都有显著性的差异(P＜0.01);6h模型对照组可见MMP-2的明显表达,24h持续增高至最高峰,48h-72h逐渐减少,但仍明显高于正常组,8天还有高水平的表达;经电针治疗后,除6h电针治疗组外,其余电针治疗组各时间点MMP2的表达明显的减少,6h电针治疗组分别与6h模型对照组和8天模型对照.组比较,MMP-2的表达均无统计学意义(P＞0.05);其余电针治疗组与对应时间点的模型对照组MMP-2的表达比较有显著性的差异(P＜0.01),与8天模型对照组比较有显著性的差异(P＜0.01)。电针能够降低脑出血大鼠血肿周围组织MMP-2的表达。
结论：
本研究表明在脑出血后的急性期选取百会、水沟、足三里进行电针治疗,除6h电针治疗组外,其余各时间点电针治疗均能明显降低脑出血大鼠血肿周围组织ICAM-1、MMP-9、MMP-2的表达,升高TIMP-1的表达,从而发挥抗脑出血后炎症反应的作用,是针灸具有多靶点、多通道作用于炎症细胞和神经元的结果。