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鲫鱼疱疹病毒病是目前发现的唯一感染异育银鲫的病毒性疾病,该病的病原为鲤疱疹病毒2型（CyHV-2）。CyHV-2又名金鱼造血器官坏死病毒（GFHNV）或疱疹造血器官坏死病毒（HVHNV）,金鱼、鲫及其普通变种均对该病毒易感,首次发现是在日本,导致日本金鱼大规模死亡,给日本金鱼养殖业造成了巨大损失。随着国际贸易的日益增加,目前该病已在世界各地区广泛传播,引起各国的高度重视。本研究主要对CyHV-2的ORF5截短基因（登录号:AFJ20457.1）进行生物信息学分析,并对该基因进行克隆,构建重组原核表达质粒,在体外进行重组质粒的诱导表达及蛋白的纯化,免疫试验动物,旨在探索ORF5截短蛋白的免疫原性,以期为CyHV-2的进一步研究提供参考依据。1、CyHV-2 ORF5截短基因的生物信息学分析本研究根据GenBank上已登录的CyHV-2的ORF5截短基因序列为模板,设计引物,经PCR扩增获得目的基因,将其插入pMD19-T载体中,构建重组质粒,经测序验证正确后,运用生物信息学软件对其进行分析。结果表明:目的基因长357bp,是一个完整的开放阅读框,编码119个氨基酸,目的基因相对分子质量为13059.70 μ,含9个强碱性氨基酸（K,R）,16个强酸性氨基酸（D,E）,42个疏水氨基酸（A,I,L,F,W,V）,38个极性氨基酸（N,C,Q,S,T,Y）。目的基因无信号肽,无跨膜区。蛋白的最大疏水指数为1.578,最小疏水指数为-2.500,亲水氨基酸分布比较均匀,且亲水氨基酸的数量大于疏水氨基酸,含有4个抗原表位。2、CyHV-2 ORF5截短基因原核表达载体的构建及重组蛋白表达条件的优化以PET-32a载体作为表达载体,插入目的基因,构建重组原核表达质粒PET-32a-ORF5（截短）,经PCR扩增及双酶切鉴定之后,将重组质粒转入表达菌BL21中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明目的基因获得表达,重组融合蛋白大小约为33 kDa。对蛋白表达形式进行分析,结果表明表达产物主要以包涵体的形式存在,对蛋白表达条件进行优化,结果表明表达的最优条件为0.4 mM的IPTG诱导4 h。3、重组蛋白免疫原性研究本研究采用包涵体纯化法,对表达蛋白进行纯化回收后,测定蛋白浓度为0.534 mg/mL。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备重组蛋白的高免血清。经Western blot分析表明,重组蛋白具有良好的特异性。将异育银鲫分为4组,每组20尾,其中3组为实验组,分别免疫10 μg蛋白,25 μg蛋白和50 μg蛋白,免疫3次,每次间隔一周,1组空白对照,注射生理盐水,在第0d、7 d、14d、21 d、28 d分别采血,收集血清,用ELISA方法检测抗体,分析异育银鲫抗体产生水平。结果表明在注射重组表达蛋白的异育银鲫血清中均可检测到CyHV-2的特异性抗体,第3次免疫之后抗体水平达到最高值,随后抗体水平开始下降,而注射生理盐水的异育银鲫血清中未检测到抗体;注射重组表达蛋白剂量不同,异育银鲫血清中抗体水平有差异,免疫50 μg蛋白组的异育银鲫产生抗体水平最高,免疫10 μg蛋白组的异育银鲫产生抗体水平较低,但与对照组比较抗体水平差异显著（p＜0.05）。在第3次免疫后的第二周,分别向4组异育银鲫体内注射5 TCID50浓度的CyHV-2细胞培养液,进行攻毒保护试验,结果表明,注射生理盐水组保护率为0,注射10μg蛋白组保护率为20%,注射25μg蛋白组保护率为30%,注射50 μg蛋白组保护率为35%。综上,ORF5截短蛋白具有免疫原性,对异育银鲫具有保护作用,但是保护率较低。