论文部分内容阅读
目的：通过特异性的单重PCR检测手部非结核分枝杆菌,寻找快速、准确的诊断方法。方法：取临床病例手部NTM感染的病灶组织20例,一份行病理检测,一份提取病灶组织中非结核分枝杆菌DNA。选取感染手部常见的非结核分枝杆菌常见菌种,通过Genbank数据库和文献找到非结核分枝杆菌亚种的特异性基因片段5种,分别是hsp65、ITS2、 IS1245、IS2404、P6123,根据靶序列设计引物。提取临床标本及标准菌株的总DNA进行靶序列的PCR,扩增条件如下：退火温度55℃、退火温度梯度52～63℃及63～70℃,引物浓度及循环次数分组,并计算检测率,采取卡方检验,找到本实验的最适宜条件。在最适宜PCR反应体系下进行临床标本与标准菌株DNA扩增,通过凝胶电泳的目的条带比对,达到鉴定非结核分枝杆菌种及亚种,并进行靶序列测序。结果：1.临床标本组织单重PCR扩增出的目的条带,与标准菌株海分枝杆菌、胞内分枝杆菌扩增出的目的条带均符合。2.20例临床标本组织检测结果：海分枝杆菌11例,胞内1例,鸟分枝杆菌1例,2例标本出现双重感染,1例是海分枝杆菌和胞内分枝杆菌混合感染,1例是鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌混合感染,5例未检测出。3.退火温度63℃、反应体积20ul、引物浓度2.5umol/L或5umol/L、循环30次或35次是本实验最佳条件。4.DNA测序结果,标准菌株海分枝杆菌及胞内分枝杆菌与Genebank数据库中海分枝杆菌与胞内分枝杆菌的同缘性达99%,偶然分枝杆菌达100%,临床标本PCR产物测序序列与Genbank数据库比对,与海分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌同缘性达98%以上,临床标本PCR产物测序结果与标准菌株测序结果比对,临床标本测序序列均符合标准菌株序列。结论：1.应用特异性的单重PCR检测手部非结核分枝杆菌感染,可早期、准确、可靠地检测出致病菌,可以鉴定非结核分枝杆菌到种及亚种。2.PCR条件优化后,推断本检测方法更加经济、快速。