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背景与目的炎症是人类多种疾病中一种最常见的病理过程,可发生于机体的任何部位和组织,是机体对感染或创伤等引起的内环境紊乱的正常反应。但是过度的炎症反应会引发全身炎症反应综合症,导致机体组织细胞自身性损害,表现为脓毒症,脓毒性休克甚至多器官功能障碍综合征。临床上革兰氏阴性菌感染引起的炎症反应损伤是一种常见疾病,往往难于控制,严重时可引起内毒素血症或感染性休克,危及病人生命。革兰氏阴性菌细胞外膜的活性成分内毒素即脂多糖(LPS)是引发急性炎症反应的关键致病物质,它能激活机体单核吞噬细胞系统,产生一系列炎性介质,导致疾病的发生和发展。新近发现并广为研究的Toll样受体2(TLR2)与LPS引起的免疫反应及其导致的机体损伤有很大的关系,TLR2识别的配体最多,参与人体内对LPS的反应,介导炎症信号传入胞内激发一系列炎症反应,在识别各种病原微生物引发机体的固有免疫应答反应中扮演重要的角色。现已证实多种致炎细菌成分都直接或间接激活TLR2继而使白细胞活化,白细胞活化后,一方面杀灭细菌,另一方面又释放多种致炎介质和细胞因子导致炎症反应,剧烈过度的全身性炎症反应则可影响多个脏器并最终导致不可逆的病理损伤。因此,阻断或抑制TLR2的激活,则有可能抑制白细胞的活化,阻断白细胞炎性介质的合成与分泌,避免多种细菌成分导致的严重炎症反应的发生。由于可溶性TLR2胞外区蛋白(sTLR2)具有和白细胞膜上天然的TLR2受体胞外区相同的与细菌成分相结合的能力,理论上sTLR2可以通过竞争性抑制白细胞膜上相应受体的激活,从而阻止白细胞活化和释放炎性介质进而达到抗炎治疗的目的。基于此,本实验采用腺病毒表达策略,首先克隆人TLR2胞外区基因,然后制备携带TLR2胞外区基因的重组腺病毒载体,获得可以表达sTLR2的高滴度纯化病毒,观察重组腺病毒介导sTLR2在动物模型体内的抗炎作用,以探明sTLR2的抗炎机制,为急性炎症反应的防治提供新的思路和治疗策略。研究方法1.分离健康人外周血单个核细胞,提取其RNA作为模板采用RT-PCR方法扩增人TLR2胞外区cDNA。目的基因经纯化后将其亚克隆至pUCm-T载体上构建重组质粒pUCm-TLR2,选取鉴定正确的克隆测序,并将测序结果与GenBank中人TLR2胞外区基因序列进行同源性比较分析。2.将测序正确的TLR2胞外区目的片段定向克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上构建重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2,将阳性重组子酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在E.coli BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-TLR2。3.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2以脂质体法转染293细胞中进行包装并且扩增病毒。观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,纯化并测定病毒滴度,以PCR方法鉴定重组腺病毒并进行野生型病毒检测分析其应用的安全性。4.建立致死剂量LPS所致炎症动物模型;40只BALB/c小鼠随机分为A和B两个实验组,重组腺病毒AdTLR2于致炎之前(A实验组)和致炎之后(B实验组)分别作用于炎症小鼠,观察其对小鼠生存时间的影响。5.建立小剂量LPS所致炎症动物模型;40只BALB/c小鼠随机分为四组:正常对照组(尾静脉注射0.9%生理盐水)、炎症对照组(腹腔缓慢注射小剂量LPS溶液)、重组腺病毒AdTLR2 A组(LPS致炎之前尾静脉注射病毒悬液)、重组腺病毒AdTLR2 B组(LPS致炎之后尾静脉注射病毒悬液)。观察48h后,摘眼球取血,分离血清,应用酶联免疫吸附实验(ELISA)对血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量变化进行检测,探讨AdTLR2对小鼠血清细胞因子水平变化的影响。结果1.从健康人外周血单个核细胞中应用RT-PCR技术成功扩增TLR2胞外区cDNA,并且成功构建重组质粒pUCm-TLR2。2.经测序及序列同源性比较,本实验所克隆的目的片段长度为1764bp,测序结果无碱基突变与GenBank中人TLR2胞外区基因序列完全吻合。3.经双酶切及DNA测序鉴定,证实插入序列和读码框架正确,重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR2构建成功。4.重组腺病毒穿梭质粒与骨架质粒通过在E.coli BJ5183内的同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-TLR2,经PacⅠ酶切后可见一条约30kb大小的条带和一条4.5kb的特征性条带,表明同源重组成功。5.将线性化的重组腺病毒质粒pAd-TLR2转染293细胞后,在荧光显微镜下可以观察到明亮的绿色荧光,并且出现典型的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),说明重组腺病毒包装成功。6.扩增后收集病毒,经氯化铯密度梯度离心纯化获得3×109 PFU/mL的高滴度重组腺病毒AdTLR2,以PCR鉴定其携带有所克隆入的TLR2胞外区目的基因,并且经检测无野生型病毒存在。7. BALB/c小鼠经腹腔注射LPS后成功复制内毒素血症炎症动物模型,制备的重组腺病毒AdTLR2对小鼠无明显的毒性作用,实验动物对病毒耐受良好。8.重组腺病毒AdTLR2作用于致死剂量LPS所致炎症动物模型后,A实验组和B实验组小鼠的生存时间与炎症对照组比较相对延长。9.重组腺病毒AdTLR2作用于小剂量LPS所致炎症动物模型后,AdTLR2 A组和AdTLR2 B组中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的血清水平均较炎症对照组有所降低,差异显著具有统计学意义(P<0.05),AdTLR2 A组与AdTLR2 B组数据之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.成功克隆TLR2胞外区基因cDNA全部编码序列,经测序及序列同源性比较,证实目的基因无碱基突变与GenBank中所提供的相关序列完全吻合。2.应用AdEasy System腺病毒表达系统成功构建携带有TLR2胞外区基因的重组腺病毒载体AdTLR2,经293细胞扩增、纯化后获得3×109 PFU/mL的高滴度重组腺病毒,此在国内外尚未见报道。3.制备的重组腺病毒AdTLR2能够使LPS所致炎症小鼠模型的生存时间相对延长,并且能够降低炎症小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,提示AdTLR2在活体内可以分泌sTLR2蛋白并且发挥免疫调节的作用,能够抑制血清中炎性细胞因子的表达水平,具有一定的抗炎作用。