目的:1.表达和纯化重组的人胱抑素C(cystatin C,Cys C)蛋白;2.鉴定纯化的重组Cys C蛋白;3.重组Cys C蛋白的免疫活性的检测。方法:1.根据Gen Bank中人Cys C功能区的氨基酸序列,选择大肠埃希菌喜好的编码密码子设计合成编码基因序列,利用PCR(聚合酶链式反应)获取目的片段,在原核系统中表达重组人胱抑素C蛋白。2.纯化表达的Cys C重组蛋白,用间接酶联免疫吸附测定法(间接ELISA法)测定其反应灵敏度及免疫活性。结果:1.PCR扩增Cys C后经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,在250~500bp位置处发现唯一一条清晰的、大小约为450bp的DNA条带,相对分子质量大小与Cys C基因大小相符,因此可初步确定为目的条带。构建的重组载体p MD18-T-Cys C,经Bam H I和Xho I双酶切鉴定后可见两条条带,与预期结果一致,经过上海生工公司测序,证明为Cys C编码序列;2.将连接表达载体的连接物诱导表达,SDS-PAGE后发现诱导后的菌株表达了一个大小约为35k D的蛋白,而在对照组中没有出现这一条带,初步说明重组基因在大肠杆菌中获得了有效表达;3.Western Blotting结果显示,表达的重组蛋白与抗Cys C多克隆抗体在大小约为35k D处发生了反应,而阴性对照则没有此条带的出现,进一步说明了重组蛋白为Cys C蛋白,并且具有良好的免疫反应活性;4.间接ELISA结果显示,在包被浓度为0.5mg/L时便产生了阳性值(一般以阴性值的2.1倍设为临界值),表明该重组蛋白具有极高的反应灵敏度。结论:1.成功建立了Cys C原核表达系统;2.Cys C重组蛋白具有良好的反应灵敏度;3.Cys C重组蛋白免疫小鼠后血清中Ig G效价已达制备单克隆抗体的要求,为Cys C单克隆抗体的制备打下夯实的基础。