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第一章miR-200及其靶基因TCF12和Fli-1通过调节乳腺癌CAFs细胞的活化和细胞外基质重塑促进乳腺癌细胞的侵袭转移目的:探索miR-200s使CAF活化,调控ECM蛋白的异常沉积,并促进乳腺癌细胞的侵袭转移。方法:(1)原代分离获得乳腺癌病人来源的正常成纤维细胞(NF:Normal fibroblast)和肿瘤相关成纤维细胞(CAF:Cancer-associated fibroblast)。(2)qRT-PCR检测这20对NF和CAF细胞中miR-200s的表达。(3)利用Transwell共培养系统,将乳腺癌细胞与NF细胞共培养,qRT-PCR检测miR-200s的表达。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶实验确定miR-200s的靶基因。(5)利用sh RNA和基因过表达技术,验证miR-200s及其靶基因促进CAF的活化。(6)利用胶收缩、qRT-PCR和Western Blot实验验证miR-200s及其靶基因对ECM重塑的影响(7)癌细胞侵袭实验和裸鼠成瘤模型验证miR-200s及其靶基因促对乳癌转移的影响。结果:(1)原代培养获得20对成对的乳腺癌病人来源的NF和CAF细胞。(2)qRT-PCR结果显示miR-200s在CAF中下调的真实性和普遍性。(3)qRT-PCR检测发现经癌细胞共培养激活的NF细胞中miR-200s表达下调。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶实验表明TCF12和Fli-1分别是miR-141和miR-200b的靶基因。(5)利用sh RNA和基因过表达技术,发现低表达miR-200s的NFs具有活化的CAFs的特征,CAF活化标志物a-SMA、FAP表达增加,其迁移侵袭能力增强;CAFs中恢复miR-200s的表达,部分抑制CAF功能并出现NF表型特征。(6)利用胶收缩、qRT-PCR和Western Blot实验验证miR-200s及其靶基因通过调控下游一系列ECM成分相关基因,尤其是FN和LOX的表达,促进ECM重塑。(7)体内裸鼠实验和临床病例研究更进一步证实miR-200s及其靶基因对CAF活化、ECM重塑、乳癌转移的影响。结论:(1)下调的miR-200s导致细胞分化相关的靶转录因子Fli-1和TCF12异常表达,促进乳腺癌CAFs活化。(2)miR-200s及其靶基因Fli-1和TCF12介导了乳癌微环境ECM重塑,促进肿瘤细胞的侵袭与转移。揭示CAFs促进乳腺肿瘤转移的新的分子机制,为靶向肿瘤微环境的治疗提供新靶点。第二章离体CAFs活化的自我维持目的:探索miR-200s维持CAF的活化状态及机制。方法:(1)5’-aza处理CAF细胞,qRT-PCR检测miR-200s的表达。(2)Western Blot检测成对NF和CAF细胞中甲基化转移酶的表达差异。(3)利用基因干扰技术,沉默CAF细胞中Dnmt3b的表达,qRT-PCR检测miR-200s的表达。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶验证miR-200b/200c的靶基因Dnmt3b。(5)TGF-b1处理CAF后,qRT-PCR检测miR-200s的表达,Western Blot检测Dnmt3b及miR-200s的靶基因TCF12和Fli-1的表达。结果:(1)5’-aza处理CAF细胞,qRT-PCR发现miR-200s表达增加。(2)Western Blot结果显示CAF细胞中Dnmt3b表达明显高于NFs。(3)qRT-PCR结果显示沉默CAF细胞中Dnmt3b的表达,miR-200s表达增加。(4)qRT-PCR、Western Blot和双荧光素酶结果显示Dnmt3b是miR-200b/200c的靶基因。(5)qRT-PCR发现TGF-b1处理CAF细胞,qRT-PCR结果显示miR-200s下调,撤离外源性TGF-b1并正常培养CAF细胞,miR-200s持续低表达;而Western Blot结果显示Dnmt3b表达增加,同时靶基因TCF12和Fli-1的表达也增加。结论:(1)CAF细胞中,Dnmt3b高表达,并可能通过基因甲基化使miR-200s表达下调。(2)CAF细胞中,Dnmt3b与miR-200s形成反馈调控环,维持CAF活化。(3)TGF-b1参与调节Dnmt3b-miR-200s环路,促进并维持CAF活化。(4)Dnmt3b与TGF-b1形成正反馈调节环,维持CAF的活化。