研究背景胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤,曾以“平滑肌瘤、平滑肌肉瘤及神经鞘瘤”等作为诊断分类。1983年,Mazur等人根据免疫组织化学检测和电子显微镜观察的结果,首先提出了胃肠道间质瘤的概念。进一步研究发现:约一半以上GIST发生与C-kit基因和PDGFRA基因突变有关,这为基因靶向治疗GIST提供了重要方向。以伊马替尼为代表的小分子酪氨酸激酶抑制剂能获得相当确实的疗效,但对部分患者仍出现了耐药。GIST这种胃肠道肿瘤常表现出与其表观形态不一致的生物学特性,其在侵袭和增殖趋势上往往更倾向于恶性肿瘤的特点:如易侵袭破坏胃肠道、血管等组织,易发生远处转移,极快的生长速度,对抗肿瘤药物耐药等等。这也让我们必须重视GIST增殖、侵袭及凋亡机制的研究,以便获得对GIST更准确的诊断,做出更及时有效的治疗。MAPK通路(Mitogen-activaed protein kinase)是现今研究较为深入的一条信号传导途径,它广泛存在于人体各种细胞之中且与多种肿瘤发生和发展相关。该通路由多条平行三级联信号组成,现今已在哺乳动物中发现了六种MAPK家族亚群:细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶1/2/3(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK1/2/3)、p38 MAPK、ERK7/8、ERK3/4和ERK5。众多MAPK通路研究最为透彻和最早发现的是Raf-MEK-ERK(ERKMAPK)通路。其中ERK1/2蛋白(细胞外信号调节蛋白激酶1/2)为MAPK,是该信号通路中的核心分子,其与上游激活分子和下游效应分子组成一个高效而准确的信号传导体系;而MEK1/2蛋白为MAPKK(MAPK激酶),他可以激活ERK1/2蛋白上的Thr和Tyr两个位点,从而使其磷酸化激活,产生活化态的P-ERK1/2;Raf-1蛋白为上游的MAPKKK(MAPKK Kinase),可以通过磷酸化MEK1/2得到P-MEK1/2,进而使整条通路活化。该通路受细胞周期和细胞外刺激调控,从而调节下游的诸多蛋白激酶、磷脂酶和转录因子,发挥重要的生物功能。RKIP蛋白是Raf-1蛋白的天然抑制蛋白,其在生物体内广泛存在,RKIP蛋白可以调控多条细胞传导通路,包括Raf-MEK-ERK通路(ERKMAPK)、β肾上腺素能通路(β-AR)和NFκB通路。RKIP蛋白既是一种激酶抑制剂,同时也是磷酸化靶点。其具有调控肿瘤生长、转移,影响细胞周期和凋亡等等重要和复杂的功能。近期对于RKIP蛋白研究的文章连篇累椟,例如在胃癌、肠癌、食道癌、妇科肿瘤等等都有了详实的报道。然而关于RKIP蛋白在胃肠间质瘤中表达的相关文献却寥寥可数。对于该蛋白在胃肠间质瘤生长、转移中发挥了怎样的作用?与GIST的临床资料具有何种关系?对GIST预后的影响如何?RKIP是如何影响GIST肿瘤细胞生物学功能,其机制如何?以上问题,都是我们亟待解决的。本实验中:○1将通过免疫组化方法,对RKIP在胃肠道间质瘤组织中的表达作以研究,探讨RKIP表达对GIST的临床意义,及其对预后的影响;○2通过体外实验,观察经CRISPR质粒稳定转染后各组GIST-T1细胞间增殖、转移、凋亡、细胞周期等生物学特征差异,分析RKIP蛋白对肿瘤细胞生物学影响和作用;○3采用免疫组化和Western blotting方法检测ERKMAPK通路上各关键蛋白和下位重要功能蛋白分子表达,分析RKIP影响肿瘤细胞增殖和转移的机制。通过以上研究,在为GIST的诊断、预后评估和寻找新的肿瘤治疗靶点提供依据。目的:1.本实验中,我们将通过免疫组化方法,对RKIP在胃肠道间质瘤组织中的表达作以研究,探讨表达对GIST的临床意义,及其对预后的影响,为GIST的诊断、预后评估和新的肿瘤治疗靶点提供依据。2.通过体外实验,观察经CRISPR质粒稳定转染后各组GIST-T1细胞间增殖、转移、凋亡、细胞周期等生物学特征差异,分析RKIP蛋白对GIST-T1肿瘤细胞生物学影响和作用。3.RKIP是Raf-1蛋白的抑制蛋白,其本身也直接参与调控MAPK通路下游位点(如ERKMEK)的功能。本部分实验将着重研究RKIP蛋白在ERKMAPK通路上对GISTs增殖和转移的影响与作用机制,并分析其下游各个靶点蛋白的作用和功能。方法:1.研究对象为临床病理资料完整、随访结果确切的中国医科大学附属盛京医院手术切除、病理确诊的蜡块标本63例。实验通过免疫组化方法,分析RKIP蛋白表达,并对随访完整的60例病人资料运用Kaplan-Meiier法计算生存率,进行生存分析,采用COX多元回归分析各项指标对病人预后意义,运用多种风险度评级方案比较分析,进一步明确RKIP蛋白在GISTs诊断和预后评估的价值。2.采用CRISPR质粒转染GITS-T1细胞系,经嘌呤霉素筛选获得稳定转染RKIP Activation/CRISPR CONTROL质粒GIST-T1细胞系,按实验设计分成RKIP OE组(RKIP(+)组)、Control/vector组、Control/negative组(Mock组),并采用荧光实时定量PCR检测RKIP m RNA表达水平,采用WB法检测RKIP蛋白在各组细胞中表达,进一步验证和确定转染效率。为进一步观察经CRISPR质粒稳定转染后各组GIST-T1细胞间增殖、转移、凋亡、细胞周期等生物学特征差异:1.CCK-8法检测GIST-T1细胞的增殖;2.GIST-T1细胞平板集落形成实验验证细胞增殖和恶性程度;3.Transwell小室实验检测各组GIST-T1细胞的侵袭和迁移能力;4.流式细胞仪检测GIST-T1细胞周期并分析细胞增殖;5.流式细胞仪检测各组GISTT1细胞凋亡。3.应用免疫组化方法分析第一部分63例病例标本(病例资料附表3-1)中MAPK通路下游重要蛋白激活产物P-ERK、P-MEK的表达,分析与细胞增殖相关蛋白Cyclin D、与细胞迁移相关蛋白MMP-2的表达情况,并分析其与临床资料、RKIP共表达和预后的关系;4.应用Western Blotting方法分析实验第二部分中转染后各组(RKIP OE组、CONTROLVector组、MOCK组)GIST-T1细胞中RKIP、P-Raf、ERKP-ERK、MEKPMEK、Cyclin-D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达,试讨论其调控机制。结果(Result):1.在GIST组织中,RKIP蛋白阳性表达在细胞浆和细胞膜,呈棕黄色或棕褐色颗粒,本实验63例标本中RKIP蛋白阳性表达总计34例(54%),阴性表达总计29例(46%)。采用单因素分析Kaplan-Meier法绘制RKIP差异表达相关的生存曲线。结果提示:RKIP高表达组的生存率较低表达组明显增高,差异具有统计意义。(Log-Rank分析,P=0.0015)。采用COX多元素分析结果回报:GISTs患者预后与NIH分级相关(P=0.037),Exp(B)为3.664,说明NIH危险度分级是评估患者预后的重要因素。采用3种方案对病例行危险度评估并分析发现:RKIP蛋白对GIST危险度评估具有重要意义,NIH2008改良方案和WHO2013方案对国内患者GIST危险度评估效能较高,并且RKIP表达与患者预后具有相关趋势(P=0.122),其Exp(B)值为2.855,提示RKIP表达对GIST生存期有一定的参考意义。2.○1.荧光实时定量rt-PCR结果表明:Control/Vector组(空载质粒转染GISTT1)m RNA表达为MOCK组(空白对照组)的1.712±0.261倍,略增高;而RKIP(+)组中m RNA表达为其3.344±0.545倍(P<0.05),该组表达明显高于前2组;应用Western blotting方法分析RKIP(+)/CONTROL/MOCK三组细胞中的RKIP蛋白表达量,RKIP转染组目的蛋白表达(1.651±0.063)较CONTROL/Vector组(1.261±0.095,P<0.05)和MOCK组明显增高(标准化为1.000,P<0.05),这与q-RT-PCR表达结果一致,说明RKIP质粒转染效率较高,并建立了稳定转染的GIST-T1细胞系;○2.CCK-8检测绘制生长曲线结果显示:实验组(RKIP上调转染组)较空白组(MOCK组)和对照组(CONTROLVector)GIST-T1细胞生长明显缓慢,从第三天起生长速度出现明显差异(P<0.05);○3平板集落形成实验结果显示:RKIP转染组(46.67±8.02)较MOCK空白对照组(79.33±3.51)形成集落数量明显减少(P=0.031),而与Vector/Control组比较(47.67±4.04)无明显差异(P=0.802)。以上结果表明:RKIP蛋白的上调,可以一定程度抑制GIST-T1细胞的集落形成能力;○4 Transwell小室实验结果显示:RKIP(+)组过膜细胞数为(170.00±24.98),较CONTROL/Vector组(195.67±4.51)存在细微差别(P=0.047),而和MOCK组(204.00±26.00)比较明显减少(P=0.014),说明RKIP蛋白表达会影响细胞的侵袭和迁移能力,但转染过程可能影响细胞活力,使差异趋于减小;○5流式细胞仪结果提示:经转染后高表达RKIP蛋白的GIST-T1细胞(RKIP+组)G0/G1期比例(70.60%)较其他两组(MOCK:65.77%和CONTROL/Vector:61.97%)G0/G1比例增高,且有统计学差异(P=0.017和0.001);而G2/M期及S期比例均无明显差异和统计学意义。这说明RKIP蛋白可以使肿瘤细胞抑制在G0/G1期从而抑制肿瘤细胞生长增殖,而非直接影响细胞分裂和DNA复制。○6细胞凋亡比例来看:RKIP上调表达组D4象限比例(6.40%±0.23%)较对照组(MOCK组:2.33%±0.37%,CONTROL/Vector组:1.03%±0.15%)明显增高,说明RKIP蛋白高表达有促进GIST-T1肿瘤细胞凋亡作用。3.P-ERK阳性表达与GIST核分裂数、肿瘤大小、NIH分级有关,P-ERK阳性组1年、3年、5年生存率明显低于阴性组(P=0.043);P-MEK阳性表达与GIST肿瘤大小有关(P=0.048,<2.0cm、>10.0cm组间统计比较),与预后无关(P=0.32);MMP-2阳性表达与粘膜是否受侵、NIH分级有关;Cyclin-D1阳性表达与GIST核分裂数、肿瘤大小、NIH分级有关,Cyclin-D1阳性组1年、3年、5年生存率明显低于阴性组(P=0.001);4.蛋白共表达分析:RKIP蛋白与P-MEK(r=-0.359,p=0.004)、P-ERK(r=-0.580,p<0.01)及Cyclin-D1(r=-0.648,p=0.001)表达具有负相关。RKIP蛋白与MMP-2蛋白表达,有负相关趋势,但不具有统计学意义(r=-0.14,p=0.275)。分析P-ERK蛋白与下游潜在靶蛋白Cyclin-D1表达具有正相关性(r=0.360,p=0.004),与MMP-2表达无统计学意义(r=0.218,p=0.086);5.RKIP、P-ERK、P-MEK、Cyclin-D1、MMP-2与OS的COX多因素预后分析:通过对年龄、性别、NIH2005分期、各个蛋白表达情况、核分裂象及肿瘤大小、位置等多因素进行分析COX分析表明,NIH2005可作为提示GIST预后的独立因素(P=0.027,Exp(B)=4.182)。而RKIP、P-MEK、P-ERK、Cycin-D1虽然对OS有较高的影响权重(Exp(B)=1.370、2.112、1.450、2.018),但无法作为影响预后的独立因素,因其不具统计学意义(P=0.751.257.671.470);6.Western Blotting结果分析:上调RKIP蛋白后,Raf-1蛋白表达抑制,p-MEK1/2蛋白表达下调,p-ERK1/2减少,而下游的靶蛋白如C-Myc和Cyclin-D1的表达抑制,MMP-2蛋白表达减低。结论(Conclusion):1.RKIP蛋白在GIST中表达与肿瘤大小、NIH分期、是否侵过粘膜(侵袭程度)相关,各项指标提示肿瘤恶性度越高,RKIP表达越低或缺失;与其他因素(年龄、性别、肿瘤位置等)不相关。2.RKIP蛋白对GIST危险度评估具有重要意义,NIH2008改良方案和WHO2013方案对国内患者GIST危险度评估效能较高,值得推广应用;RKIP高表达与GIST病人生存期改善相关,对病人预后具有一定提示意义。3.RKIP表达对GIST生存期有一定的参考意义,但暂不能作为GIST预后评估的独立的因素。4.RKIP蛋白对GIST-T1细胞系增殖具有抑制作用。5.RKIP高表达能够抑制GIST-T1细胞侵袭和转移。6.RKIP蛋白(高表达RKIP蛋白时)抑制细胞增生并促进细胞凋亡。7.在GIST肿瘤细胞中:P-ERK1/2蛋白可能与肿瘤生长增殖相关(高表达促进肿瘤生长),并影响了肿瘤的恶性程度及预后;P-MEK1/2蛋白影响了胃肠间质瘤肿瘤的生长,较高的P-MEK1/2可促进肿瘤的增殖;在GIST中,MMP-2蛋白影响了GIST肿瘤的转移和侵袭;Cyclin-D1蛋白表达情况,影响肿瘤生长、分化及预后。8.GIST中,RKIP蛋白表达与p-ERK1/2、p-MEK1/2及Cyclin-D1表达呈负相关性(P<0.05)。一定程度上可理解为,随着RKIP蛋白的过表达,将出现p-ERK1/2、p-MEK1/2及Cyclin-D1蛋白减低,从而影响肿瘤细胞的相关生物学活性。9.在ERKMAPK通路上,上调RKIP蛋白后,Raf-1蛋白表达抑制,将使p-MEK1/2蛋白下调,进而降低ERK蛋白激活(p-ERK1/2减少),而下游的靶蛋白如C-Myc和Cyclin-D1的表达受到抑制,从而使肿瘤细胞出现G1期抑制,增殖减慢,细胞凋亡亦可增加。而MMP-2蛋白在P-MEK-AP1(c-fos/c-Jun)-MMPs通路的调节下,也会出现表达减低,继而负向控制肿瘤迁移和侵袭能力。而GIST细胞中,存在C-Kit依赖的ERKMAPK通路的激活,却往往出现RKIP蛋白的低表达或完全失活,这正是GIST肿瘤异常增殖、转移和进展的可能机制。