第一部分microRNA-205高表达预测子宫内膜癌淋巴结转移并提示不良预后研究背景:在全世界范围内,尤其在欧美国家,子宫内膜癌是女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤。在中国妇女中,近年来由于生活方式及代谢性疾病等原因,子宫内膜癌发生率有增加的趋势。淋巴结转移是影响子宫内膜癌患者预后的主要因素之一。淋巴结切除术(或淋巴结清扫术)作为子宫内膜癌系统手术分期的组成部分,其在手术治疗疗效及对患者生存获益方面的作用一直存在争议,尤其在术前诊断为临床Ⅰ期的患者中,既包括大部分淋巴结转移发生率较低的低风险患者,也包括少部分淋巴结转移发生率较高的高危患者。为了将可能从淋巴结切除术中获益的高危患者的手术效果最大化,而对于淋巴结转移发生率较低的低风险患者,能否避免不必要的淋巴结清扫术所引起的手术并发症,我们需要术前对子宫内膜癌患者尤其是术前诊断为临床Ⅰ期的患者进行淋巴结转移的风险分层评估。术前子宫内膜组织活检病理参数如组织学类型和分化程度对预判子宫内膜癌淋巴结转移有一定参考价值,但其准确性仍有待提高。最近的一些研究一致地显示在子宫内膜癌中miR-205表达上调并且与患者不良预后相关,然而miR-205能否作为预测子宫内膜癌淋巴结转移的分子指标尚未见报道。研究目的:本研究尝试探讨miR-205在子宫内膜癌诊断性刮宫术活检标本中的表达是否能在术前即预测并筛检出子宫内膜癌尤其是术前诊断为临床Ⅰ期的患者中淋巴结转移的高危患者;同时进一步验证miR-205作为子宫内膜癌预后分子标记物的作用。方法:我们采用荧光定量PCR方法同时检测了 360例子宫内膜癌患者术前诊刮术活检组织以及子宫切除术后的石蜡切片组织标本中miR-205的相对表达。以子宫内膜癌患者术前诊刮术活检组织标本中miR-205的相对表达,以及联合诊刮术活检标本中组织分类及分化程度作为预测因子,研究其在所有子宫内膜癌患者及术前诊断为临床Ⅰ期子宫内膜癌患者中预测并筛检淋巴结转移高危患者的敏感性,特异性,阳性似然比,阴性似然比,并应用ROC(receiver operating characteristic curve,受试者操作特征曲线)评估miR-205作为预测指标的效能。除此之外,还应用(Kaplan-Meier method,乘积极限法),Log-rank检验以及Cox比例风险模型进行生存分析。结果:1.与正常子宫内膜组织相比,miR-205在子宫内膜癌患者术前诊刮术活检组织以及子宫切除术后的石蜡组织切片标本中一致地表现为高表达,均有统计学差异。2.与Ⅰ型(子宫内膜样癌)、中-高分化、无淋巴结转移的子宫内膜癌患者相比,术前诊刮术活检组织以及子宫切除术后的组织切片标本中均发现miR-205在Ⅱ型(特殊类型,如浆液性癌)、低分化及淋巴结转移阳性的患者中相对表达水平更高,均有统计学差异。3.在术前诊断临床分期为Ⅰ期的患者中,以miR-205表达升高≥14.5倍预测患者淋巴结转移的敏感性,特异性,阳性似然比,阴性似然比分别为72.5%,84.2%,4.56和0.32,总体准确性为83.0%;以R0C评估miR-205作为预测指标的效能,结果曲线下面积=0.821(P=0.004;95%置信区间,0.666-0.975)。如果将术前诊刮术活检组织miR-205的表达与组织类型及分化程度两项参数联合起来预测患者淋巴结转移,预测效能会得到进一步提高,敏感性,特异性,阳性似然比,阴性似然比分别为82.7%,83.8%,5.19和0.20,总体准确性为83.7%。4.同时,miR-205在子宫内膜癌诊刮术活检组织以及子宫切除术后的石蜡组织切片标本中的高表达均提示与患者不良预后相关。结论:在本研究数据条件下,子宫内膜癌患者诊刮术活检组织标本中miR-205的高表达能够以较高的准确性预测术前诊断为临床Ⅰ期子宫内膜癌患者的淋巴结转移风险。当并联结合子宫内膜癌患者术前诊刮术标本中组织分型及分化程度两项参数时,预测淋巴结转移的准确性进一步提高。由此表明,miR-205在子宫内膜癌术前活检标本中的高表达增加了子宫内膜癌患者术前淋巴结转移风险分层评估的准确性。此外,本研究再次显示miR-205在子宫内膜癌组织中的高表达预示着患者的不良预后。第二部分microRNA-205通过靶向PHLPP2在子宫内膜癌中发挥促癌作用研究背景:子宫内膜癌在美国是发病率第一位的女性生殖道恶性肿瘤。近年来,在我国北京、上海等较发达城市子宫内膜癌发病率上升,超越宫颈癌,成为妇女生殖器官最常见的恶性肿瘤。约75%左右子宫内膜癌可以得到早期诊断,而且子宫内膜癌中80%以上为Ⅰ型(子宫内膜样腺癌),因此大部分子宫内膜癌经过及时的以手术为主的综合治疗预后较好。然而有小部分(约15%-25%)分化差、侵袭性强的子宫内膜癌,如Ⅰ型低分化,晚期及Ⅱ型(如浆液性癌、透明细胞癌、腺鳞癌等)子宫内膜癌,即使患者接受了包括手术、放疗、化疗及内分泌等治疗,仍然会出现复发、转移以及对化疗、内分泌治疗的耐药现象,导致治疗失败,患者只能获得短期生存,最终仍会死于复发、耐药及病情进展。这部分患者常规治疗效果不理想,预后差,是目前亟待解决的临床问题。研究表明分子靶向治疗在癌症治疗领域如黑色素瘤、肺癌及乳腺癌中显示出了一定的疗效。在子宫内膜癌中,对于特殊类型、恶性程度高及易复发转移的这些病例,在常规治疗效果差的情况下,探索研究新的、潜在的可用于靶向治疗的分子靶标具有重要的临床意义及应用前景。研究目的:本部分研究在第一部分实验结果的基础上,拟进一步探讨:1.miR-205在人子宫内膜癌细胞及人正常子宫内膜上皮细胞中的表达情况;2.miR-205在人子宫内膜癌细胞中发挥什么样的生物学功能;3.miR-205发挥功能可能的作用机制。从而进一步验证miR-205是否有希望成为子宫内膜癌潜在的靶向治疗的靶点。实验方法:FQ-PCR(荧光定量PCR)检测三株人子宫内膜癌细胞(Ishikawa、HEC-1-A及AN3CA)和人正常子宫内膜上皮细胞(CP-H058)中的内源性miR-205的表达水平。转染miR-205 mimics或者miR-205 inhibitor上调或者敲低人子宫内膜癌细胞中miR-205的表达,CCK-8实验及平板克隆实验测试调控miR-205的表达后细胞增殖活力的改变;Transwell侵袭实验检测miR-205过表达或者低表达对子宫内膜癌细胞侵袭能力的影响。流式细胞术检测上调或者下调miR-205的表达对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。接下来,经生物信息学数据库预测并参考文献筛选出 PHLPP2(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2,具有PH结构域富含亮氨酸的磷酸酶2)为miR-205的靶基因;转染miR-205 mimics或者miR-205 inhibitor增强或者降低人子宫内膜癌细胞中miR-205的表达,双荧光素酶报告基因实验检测验证miR-205是否靶向结合并作用于PHLPP2的3’非翻译区;Western blotting(免疫印迹法)检测PHLPP2蛋白表达的变化。此外,以免疫组织化学染色法检测PHLPP2在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达,结合第一部分miR-205在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达,分析二者在子宫内膜癌组织中表达的相关性。结果1.三株子宫内膜癌细胞中miR-205的相对表达均高于正常人子宫内膜上皮细胞且有统计学差异(P<0.01)。三株子宫内膜癌细胞内源性miR-205的相对表达水平由低到高依次为Ishikawa、HEC-1-A及AN3CA。2.外源性上调Ishikawa和HEC-1-A细胞中miR-205的表达(转染miR-205 mimics寡核苷酸),与转染阴性对照相比,能够促进这两种子宫内膜癌细胞的增殖(P<0.01)及侵袭能力(P<0.01)。3.外源性下调AN3CA和HEC-1-A细胞中miR-205的表达(转染miR-205 inhibitor),与转染阴性对照相比,能够抑制这两种子宫内膜癌细胞的增殖活性(P<0.01)及侵袭性(P<0.01)。4.Ishikawa细胞中转染miR-205 mimics,与转染阴性对照相比,降低了Ishikawa细胞的凋亡率。AN3CA细胞中转染miR-205 inhibitor,与转染阴性对照相比,增加了 AN3CA细胞的凋亡率。5.经TargetScan7.1和miRBase数据库预测发现PHLPP2 mRNA的3’非翻译区含有miR-205的结合序列。双荧光素酶报告基因实验结果显示:在Ishikawa细胞中转染miR-205 mimics过表达miR-205,作用于PHLPP2mRNA的3’-非翻译区(野生型,包含miR-205结合位点正常序列),与转染阴性对照相比,能够降低相对荧光素酶活性。而在Ishikawa细胞中转染miR-205 mimics过表达miR-205,作用于PHLPP2 mRNA的3’-非翻译区(突变型,miR-205的结合位点含突变点),与转染阴性对照相比,不能改变荧光素酶活性。同样地,在AN3CA细胞中转染miR-205 inhibitor 下调 miR-205 的表达,作用于 PHLPP2 mRNA 的 3’-非翻译区(野生型,包含miR-205结合位点正常序列),与转染阴性对照相比,能够增高相对荧光素酶活性。而在AN3CA细胞中转染miR-205 inhibitor下调miR-205的表达,作用于PHLPP2 mRNA的3’-非翻译区(突变型,miR-205的结合位点含突变点),与转染阴性对照相比,不能改变相对荧光素酶活性。Western blotting结果表明:与转染阴性对照相比,在Ishikawa细胞中转染miR-205 mimics能降低PHLPP2蛋白表达水平,而在AN3CA细胞中转染miR-205 inhibitor升高了PHLPP2蛋白表达水平。证实miR-205直接靶向结合在PHLPP2mRNA的3’-非翻译区,在转录后水平负性调控PHLPP2的表达。6.免疫组织化学实验显示PHLPP2在子宫内膜癌组织中的阳性表达率显著低于其在正常子宫内膜组织中的阳性表达率,分别为25%和100%,P<0.01。7.结合第一部分实验结果miR-205在子宫内膜癌组织中的表达,经Spearman相关分析发现,子宫内膜癌组织中PHLPP2表达与miR-205表达呈负相关(r=-0.823,P=0.0001)。结论:1.人子宫内膜癌细胞中miR-205的相对表达高于人正常子宫内膜上皮细胞;miR-205高表达促进子宫内膜癌细胞的增殖及侵袭能力,降低其凋亡率。2.miR-205通过直接靶向作用于PHLPP2在子宫内膜癌中发挥促癌作用。3.相对于正常子宫内膜组织,PHLPP2在子宫内膜癌组织中表达显著下调,子宫内膜癌组织中PHLPP2表达与miR-205表达呈负相关。4.miR-205可能成为子宫内膜癌患者分子靶向治疗的药物靶标。本研究的创新点:1.发现miR-205在子宫内膜癌患者术前诊刮术活检组织标本中的高表达能够以较高的准确性预测术前诊断为临床Ⅰ期子宫内膜癌患者的淋巴结转移风险。当并联结合子宫内膜癌患者术前诊刮术标本中组织分型及分化程度两项参数时,预测淋巴结转移的准确性进一步提高。为未来进一步优化或者更精准地制定Ⅰ期高危子宫内膜癌患者的手术方案提供了新的思路。2.体外实验证实miR-205在子宫内膜癌中发挥癌基因的作用,并且这种促进子宫内膜癌细胞增殖、侵袭,抑制其凋亡的生物学功能是通过直接靶向作用其靶基因PHLPP2实现的。同时,揭示了 PHLPP2在子宫内膜癌中失活的一种表观遗传调控的新机制。3.发现子宫内膜癌组织中PHLPP2表达与miR-205表达呈负相关,提示二者在子宫内膜癌中的关系。不足及展望:1.miR-205作为一个有希望的子宫内膜癌淋巴结转移的预测因子,其预测价值需要前瞻性、多中心研究的进一步证实。2.有待继续深入研究miR-205在子宫内膜癌中激活的上游机制以及PHLPP2被miR-205靶向抑制后下游效应分子或者信号通路活化的机制及其在子宫内膜癌中的作用。3.本研究未实施动物体内实验检验miR-205在子宫内膜癌异种移植肿瘤中的生物学功能,从而进一步验证其作为子宫内膜癌靶向治疗靶标的可能性。有待进一步开展裸鼠体内实验。