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研究背景及目的原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC;简称肝癌）是全球发病率最高的几大恶性肿瘤之一,其死亡率位居全球恶性肿瘤死亡的第三位。我国是肝癌最高发的国家,据统计,2012年全世界约有782,500例新发肝癌病例和745,500例肝癌死亡病例,中国占了新发病例和死亡总数的50%。近年来,虽然肝癌的治疗手段不断更新（包括手术、肝移植术、放射治疗、介入治疗、射频消融治疗、靶向治疗等）,但是肝癌的总体疗效并无明显提高,复发和转移仍是影响肝癌预后的主要因素。因此,阐明肝癌侵袭转移的机制,寻找有意义的肝癌侵袭转移分子标志物,发现新的防治靶点,是当代肝癌研究的重要内容。锌指蛋白家族蛋白是真核细胞中最常见的转录因子家族之一,人类基因组有超过三千种的锌指蛋白。锌指蛋白功能广泛,包括DNA识别,RNA组装,转录激活和凋亡调控等。由于其功能的多样性,一些锌指蛋白被发现在肿瘤的发生发展中起到抑癌或者促癌的作用。锌指蛋白307（Zinc finger protein 307,ZNF307）,又名是 ZKSCAN4（zinc finger with KRAB and SCAN domains 4）,ZSCAN36andZNF427,是一个锌指蛋白基因,最初是在人类胚胎心脏文库中通过PCR扩增获得。ZNF307 cDNA分布于6号染色体上NT007592基因组序列中,包含一个1638bp的开放阅读框,编码546个氨基酸组成的蛋白。ZNF307作为锌指蛋白转录因子中的重要成员之一,可能与细胞的增殖、调亡、肿瘤的发生发展等密切相关。JingLi等发现,在细胞HEK-293中ZNF307通过上调 MDM2（p53-binding protein MDM2）和 EP300（E1 A binding protein p300）从而抑制p53和p21的转录。然而关于ZNF307在体内是否具有转录抑制的功能,在肝癌的发生发展中又起到什么作用,目前尚未有研究报道。因此,本课题的研究目的:探讨ZNF307在肝癌的发生发展中所扮演的角色,为肝癌的诊断、治疗提供新的理论依据。研究方法1、荧光定量PCR检测肝癌细胞株和组织标本中ZNF307的表达在正常人肝细胞株L02和肝癌细胞株MHCC97L,HCCLM3,Huh7,QGY7701,QGY7703,Be17402,Be174042 中提取细胞 mRNA,荧光定量 PCR检测ZNF307的表达水平。提取33例肝癌及配对癌旁组织标本的mRNA,荧光定量PCR检测组织标本中ZNF307的表达水平。2、Western blot检测肝癌细胞株和组织中ZNF307的表达在正常人肝细胞株L02和肝癌细胞株MHCC97L,HCCLM3,Huh7,QGY7701,QGY7703,Be17402,Be174042 中提取细胞总蛋白,Western blot 检测上述8株细胞中ZNF307的表达水平。Western blot检测4对肝癌及癌旁组织标本中ZNF307的表达水平。3、构建ZNF307敲低细胞株并验证转染效率利用购买自上海吉玛公司的含有ZNF307基因干扰片段的shRNA,采用稳定转染法转染相对高表达ZNF307的肝癌细胞,用含空载体的病毒做对照。荧光定量PCR和Western blot检测ZNF307干扰效率。4、构建ZNF307过表达细胞株并验证转染效率利用购买自上海吉玛生物公司的含有ZNF307基因片段的Lentivirus病毒载体转染相对低表达ZNF307基因的肝癌细胞,用含空载体的病毒做对照。荧光定量PCR和Western blot检测ZNF307过表达效率。5、ZNF307基因沉默对肝癌细胞生物学特性的影响利用平板克隆、CCK-8、划痕实验、体外侵袭实验、流式凋亡实验检测ZNF307基因沉默后对肝癌细胞体外增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。6、ZNF307基因过表达对肝癌细胞生物学特性的影响利用平板克隆、CCK-8、划痕实验、体外侵袭实验、流式凋亡实验检测ZNF307基因过表达后对肝癌细胞体外增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。7、体内实验检测ZNF307基因沉默和过表达对肝癌细胞增殖能力的影响应用上述构建的稳定干扰肝癌细胞株MHCC97L和稳定过表达肝癌细胞株Be17402,与对照组细胞分别在裸鼠左右腋下行皮下注射,每5天对裸鼠皮下瘤进行测量及数据分析,体内实验揭示ZNF307基因沉默和过表达对肝癌细胞增殖能力的影响。8、Western blot检测ZNF307基因沉默和过表达的肝癌细胞的凋亡相关蛋白表达的变化Western blot检测ZNF307基因稳定沉默和过表达的肝癌细胞的凋亡相关蛋白（Caspase3、BAX和BCL-2）的表达情况,探讨ZNF307基因影响肝癌细胞凋亡的可能机制。研究结果1、ZNF307在肝癌细胞株中mRNA及蛋白水平表达下调采用荧光定量 PCR 法检测 MHCC97L,HCCLM3,Huh7,QGY7701,QGY7703,Be17402,Be174042共7株人肝癌细胞和1株人正常肝细胞L02 ZNF307基因的表达情况。结果显示ZNF307在正常肝癌细胞株L02中表达明显高于 MHCC97L,HCCLM3,Huh7,Be17402 细胞（由高到低）（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05）,与 QGY7701,QGY7703 和 Be17404 细胞无明显差异,提示ZNF307基因在肝癌细胞中普遍低表达。用Western blot 检测 MHCC97L,HCCLM3,Huh7,QGY7701,QGY7703,Be17402,Be174042共7株人肝癌细胞和1株人正常肝细胞L02 ZNF307蛋白的内源性表达,结果显示ZNF307蛋白在正常肝癌细胞株L02中表达明显高于MHCC97L,HCCLM3,Huh7,Be17402 细胞（由高到低）,与 QGY7701,QGY7703和Be17404细胞无明显差异,提示ZNF307蛋白在肝癌细胞中普遍低表达。Western blot检测ZNF307蛋白表达水平与荧光定量PCR检测的RNA表达水平趋势基本一致。2、ZNF307在肝癌组织中mRNA及蛋白水平表达下调利用荧光定量PCR检测33对肝细胞癌组织及癌旁正常肝组织ZNF307的mRNA水平表达。结果显示ZNF307在肝癌组织中表达低于癌旁正常肝组织（Z=-4.404,P<0.001）,ZNF307在肝细胞癌组织转录水平下调。利用Western blot检测4对肝细胞癌组织及癌旁正常肝组织ZNF307的蛋白水平表达。结果显示ZNF307在肝癌组织中的表达明显低于癌旁正常肝组织,ZNF307在肝细胞癌组织蛋白翻译水平下调。3、ZNF307基因沉默对肝癌细胞生物学特性的影响（1）构建ZNF307敲低细胞株并验证转染效率:应用含有ZNF307干扰片段的shRNA稳定转染外源性表达ZNF307较高的肝癌细胞MHCC97L和QGY7701。荧光定量PCR和Western blot分别证实干扰组较对照组ZNF307表达降低,有显著差异（MHCC97L:t=69.640,P<0.001;QGY7701:t=43.725,P<0.001）。（2）ZNF307干扰后促进肝癌细胞株体外增殖能力:CCK-8实验、平板克隆实验证明,与对照组相比,干扰ZNF307细胞体外增殖能力（MHCC97L:F=62.066,P<0.001;QGY7701:F=10.525,P<0.001）和克隆能力增强（MHCC97L:t=7.252,P<0.05;QGY7701:t=10.713,P<0.001）。（3）ZNF307干扰后促进肝癌细胞株体外侵袭能力:Transwell小室检测细胞侵袭能力,实验证明,与对照组相比,干扰ZNF307细胞体外侵袭能力增强（MHCC97L:t=13.976,P<0.001;QGY7701:t=25.652,P<0.001）。（4）ZNF307干扰后促进肝癌细胞株体外迁移能力:划痕实验检测细胞迁移能力,实验证明,与对照组相比,干扰ZNF307细胞体外迁移能力增强（MHCC97L:t=22.979,P<0.001;QGY7701:t=19.489,P<0.001）。（5）ZNF307干扰后抑制肝癌细胞株凋亡:流式细胞仪检测细胞凋亡率,实验证明,与对照组相比,干扰ZNF307细胞凋亡率明显降低（MHCC97L:t=8.414,P<0.05;QGY7701:t=47.369,P<0.001）,提示 ZNF307 沉默抑制肝癌细胞凋亡。4、ZNF307基因过表达对肝癌细胞生物学特性的影响（1）构建ZNF307过表达细胞株并验证转染效率:应用含有ZNF307-cDNA的慢病毒稳定转染外源性表达ZNF307较低的肝癌细胞Be17402和HCCLM3。荧光定量PCR和Western blot分别证实过表达组较对照组ZNF307表达升高,有显著差异（Be17402:t=105.364,P<0.001;HCCLM3:t=126.165,P<0.001）。（2）ZNF307过表达后抑制肝癌细胞株体外增殖能力:CCK-8实验、平板克隆实验证明,与对照组相比,过表达ZNF307细胞体外增殖能力（Be17402:F=27.136,P<0.001;HCCLM3:F=4.541,P<0.05）和克隆能力降低（Be17402:t=16.670,P<0.001;HCCLM3:t=10.169,P<0.05）。（3）ZNF307过表达后抑制肝癌细胞株体外侵袭能力:Transwell小室检测细胞侵袭能力,实验证明,与对照组相比,过表达ZNF307细胞体外侵袭能力降低（Be17402:t=8.358,P<0.05;HCCLM3:t=24.607,P<0.001）。（4）ZNF307过表达后抑制肝癌细胞株体外迁移能力:划痕实验检测细胞迁移能力,实验证明,与对照组相比,过表达ZNF307细胞体外迁移能力降低（Be17402:t=19.176,P<0.001;HCCLM3:t=6.031,P<0.05）。（5）ZNF307过表达后促进肝癌细胞株凋亡:流式细胞仪检测细胞凋亡率,实验证明,与对照组相比,过表达ZNF307细胞凋亡率明显升高（Be17402:t=7.790,P<0.05;HCCLM3:t=17.451,P<0.001）,提示ZNF307 过表达促进肝癌细胞凋亡。5、ZNF307基因沉默和过表达对肝癌细胞体内增殖的影响裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比,ZNF307干扰后皮下成瘤的增殖能力增强（F=31.378,P<0.05）。相反,ZNF307过表达后皮下成瘤的增殖能力降低（F=33.629,P<0.05）。6、ZNF307基因沉默和过表达对肝癌细胞的凋亡相关蛋白表达的影响Western blot 检测 MHCC97L干扰 ZNF307 和 Be17402 过表达 ZNF307 后凋亡相关蛋白（Caspase3、BAX和BCL-2）的表达情况,发现沉默ZNF307后Caspase3和BAX表达降低,BCL-2表达升高。相反,过表达ZNF307后Caspase3和BAX表达升高,BCL-2表达降低,提示ZNF307基因可能通过调控凋亡通路相关蛋白从而促进肝癌细胞凋亡。结论1、ZNF307基因/蛋白在人肝癌细胞/组织中的表达明显降低。2、ZNF307基因抑制肝癌细胞体内外增殖、侵袭、迁移及促进肝癌细胞凋亡。3、ZNF307基因可能通过调控凋亡通路相关蛋白促进肝癌细胞凋亡。