宫颈癌是我国常见的恶性肿瘤之一,放射治疗是治疗中晚期宫颈癌的一种非常重要的方法,宫颈癌5年生存率近20年没有明显的改变,总生存率在50%左右。目前我们常用的经典方法就是以DT2Gy/天,DT10Gv/周的常规分割放射治疗。然而实践证明此方法并非对任何来源,任何时期的肿瘤都是最佳方法。因此人们努力的寻找各种更有效的方法,其中改变时间剂量因素是提高疗效的重要研究途径之一。非常规分割放疗是放射肿瘤学家寻求到的一种新的放疗方案,并已在头部鳞癌的临床治疗中取得良好的效果。受此启发国外少数学者将此技术引入宫颈癌的治疗,Kavanagh BD分别两次报道两个独立小样本研究结果,显示在降低了毒副作用的基础上,超分割技术和后程加速超分割技术对晚期宫颈癌局部控制和生存率高于用常规分割治疗的病人。这一方法能提高肿瘤的局部控制,降低并发症。肿瘤放射治愈意味着肿瘤干细胞丧失无限增殖能力。但是近几年放射生物学研究表明,在放射过程中肿瘤干细胞能补偿性的加速再增殖,使控制肿瘤的等效剂量发生变化。肿瘤干细胞的加速再增殖是常规放疗失败的原因之一。目前检测细胞放射后是否出现加速增殖的直接指标就是其克隆源性细胞的增殖能力,间接可以通过肿瘤细胞潜在性倍增时间(Potential doubling time,Tpot)的变化来确定。本试验就是立志于检测宫颈癌Hela细胞被照射后否存在加速增殖,以及加速增殖出现的时间和部分与增殖有关的基因的表达水平的变化。为达到此检验目的。首先我们还要初步了解Hela细胞在我院各方面试验条件下,其细胞辐射敏感性以及辐射动力学基线的各项变化指标,寻找辐射敏感剂量点和增殖敏感时间点,为后续的各项试验做好准备。应用MTT法检分别测照射组(2,4,6,8Gy四个放射剂量)单次照射与对照组(0Gy组)作用下HELA细胞在随后的24h及6天内的生长活力和增殖动力学变化趋势并进行统计学分析,为后续试验选择相对的辐射敏感检测点及辐射敏感剂量点。结果显示在不同剂量照射下Hela细胞的增殖变化趋势不尽相同,照射计量越大最终对细胞的损伤就越大。24小时内相对在3～6小时的时间段中Hela细胞的增殖速度最快,属于增殖敏感阶段。6天内对照(0Gy)组与2Gy组生长变化无差异(P>0.05)。这些结果说明我们要(1)选择不同的照射组进行后续试验,并比较组间差异,了解Hela细胞与辐射剂量依存的关系。(2)可在3～6小时中选择后续试验的敏感检测时间点。(4)因2Gy组的Hela细胞6天生长情况下与对照组无差异,在后续试验中可将2Gy删除,余下4、6、8Gy组作为放射敏感剂量点。采用细胞计数法,平板克隆形成试验以及流式细胞仪法检不同辐射剂量下Hela细胞Tpot变化的情况、克隆形成情况、以及细胞增殖周期的变化,并推断Hela细胞辐射后是否会出现加速增殖,出现加速增殖的时间。结果显示不同剂量单次照射后Hela细胞Tpot的缩短。并且单次放射剂量越大,后续Tpot就越小(P<0.01),成计量依赖关系。辐射剂量越大细胞克隆形成率就越小(P<0.05),进而统计推断其与Tpot有正相关性(P<0.05)。在检测起始两天内细胞周期表现为S期的轻微上调以及G2期的下调,而在后续时间中就出现了S期和G2期的共同下调。这些结果说明(1)辐射后Hela细胞的确会出现加速增殖,加速增殖出现于辐射后的早期阶段约在第一天～第三天之间,结束时间目前不明。(2)细胞的增殖速度决定于肿瘤干细胞的增殖能力,试验中Tpot缩短对应着克隆形成的减小,这说明残余的有增殖活力的肿瘤干细胞处于加速增殖的状态。(3)细胞周期检测早期阶段有S期的上升表现为SPF及PI指标的增高,这样说明Hela细胞出现了加速增殖。在辐射后期S期和G2期细胞比率减少,说明辐射对肿瘤细胞的杀伤或诱导调亡的作用是一个渐进的过程,辐射后期大量细胞凋亡或死亡出现了周期的明显变化。(4)S期和G2期细胞比率降低说明辐射对细胞抑制发生在G1—S期,S—G2期两个检验点中。采用PT-PCR法,免疫细胞化学法检测不同辐射剂量下,宫颈癌Hela细胞中与增殖有关的PCNA,Ki-67基因、蛋白的表达情况。从分子角度分析辐射都与Hela细胞增殖动力学的影响。PCR检测结果显示于辐射后一、二天Hela细胞出现有PCNA、Ki-67的增高,把第一天的数据进行组间比较析,可以看出在照射组和对照组之间的确是有差异的(P<0.05)。随后表达开始逐渐降低,8Gy组于照射检测末期甚至测不到Ki-67的表达,而PCNA的表达也不足放射后第一天的一半。免疫细胞化学显示,细胞的确出现大量的放射性损伤,但在蛋白检测中,Ki-67和PCNA在对照组和放射组之间的表达均无统计学意义(P>0.05).结论:(1)RT-PCR检测早期PCNA,KI-67的高表达,这是细胞增殖活跃的表现。与对照组有差异说明的确出现了加速增殖。(2)随后表达的逐渐降低是因为大量的细胞进行性凋亡甚至死亡或停止生长分化,不在有增殖能力的表现。这与流失细胞仪的监测结果也相一致。(3)免疫细胞化学没有检测到PCNA,Ki-67蛋白的表达差异的原因可能是多种多样的,但是最常见的是蛋白表达不敏感、记数误差大造成的。