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硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是继一氧化氮、一氧化碳之后发现的第三种新的气体信号分子。在多物种、不同类型的外周血管上,H2S的血管舒张作用都得到了证实,但未见H2S对脑血管作用的报道。脑血管内皮损伤是脑缺血性疾病病理生理过程中的一个重要事件,H2S对脑血管内皮细胞有无保护作用及其机制尚不明确。杜鹃花总黄酮(total flavones of rhododendra,TFR)有很好的抗缺血性脑损伤作用,但尚不明确其作用是否与H2S有关。本研究试图通过si RNA基因沉默技术及其它相关技术,观察H2S对脑血管内皮舒张反应的影响及涉及的离子通道,并利用缺氧再给氧脑微血管内皮细胞模型,观察H2S对脑血管内皮的保护作用及其与SIRT6的关系。在CSE-si RNA体内转染大鼠和CSE-KO小鼠模型,探讨了TFR抗脑缺血再灌注损伤作用与H2S的关系。实验目的:1.观察H2S对脑血管内皮舒张作用的影响及涉及的离子通道;2.观察H2S对脑血管内皮细胞缺氧再给氧损伤的保护作用及其与SIRT6的关系;3.观察TFR的抗脑缺血性损伤作用及其与H2S的关系。实验方法:1建立大鼠CSE-si RNA体内转染模型,q-PCR法检测血管CSE-m RNA的表达,全自动酶标仪测定血管H2S生成量。2采用离体血管张力实验,观察ACh、H2S合成底物L-Cys及TFR对大鼠脑血管的舒张作用,同时观察去内皮及PPG(CSE抑制剂)对其舒张作用的影响;观察外源性H2S供体Na HS对大鼠脑血管的舒张作用,同时观察Apamin(SKCa通道阻滞剂)、Ch Tx(IKCa通道阻滞剂)、Iberiotoxin(BKCa通道阻滞剂)及Glibenclamide(KATP通道阻滞剂)对Na HS血管舒张反应的影响。3采用离体血管张力测定实验,观察ACh、L-Cys及TFR在CSE-si RNA体内转染大鼠脑血管舒张作用的变化;观察TFR在CSE-KO小鼠基底动脉和主动脉舒张作用的变化。4建立局灶性大鼠脑缺血再灌注损伤(I/R)模型,观察TFR对CSE-si RNA体内转染大鼠神经功能评分、脑梗死体积百分比及脑血管H2S生成的影响。5建立局灶性小鼠脑缺血再灌注损伤模型,观察TFR对CSE-KO小鼠神经功能评分、脑梗死体积百分比及脑血管H2S生成的影响。6建立b End.3细胞缺氧再给氧(OGD/R)模型,通过细胞生成率检测和LDH、SOD、CAT及ROS测定,验证H2S对细胞的保护作用;测定OGD/R细胞SIRT6的表达,观察H2S及TFR对OGD/R细胞SIRT6表达的影响。实验结果:1 CSE-si RNA大鼠体内转染48h后,与Sham组、阴性对照组及转染试剂组相比较,CSE-m RNA的表达明显降低,同时脑血管及主动脉H2S生成量也明显降低。2血管张力实验结果显示,ACh(10-8~10-5.5 mol/L)对大鼠基底动脉(BA)和大脑中动脉(MCA)有浓度依赖性的舒张作用,其最大舒张率(Emax)分别是72.88±5.02%和69.84±7.45%;加用CSE酶抑制剂PPG后,Emax明显下降;内皮去除后,ACh诱导的舒张作用消失。3血管张力实验结果显示,L-Cys(10-5~10-2.5mol/L)可浓度依赖性地舒张大鼠BA和MCA,其Emax分别是77.15±6.15%和80.37±5.36%;加用PPG和去除内皮后,Emax均明显下降。4血管张力实验结果显示,Na HS(10-5~10-2.5mol/L)可浓度依赖性地舒张大鼠BA和MCA,其Emax分别是86.45±6.12%和89.72±6.53%;去除内皮对Na HS的舒张作用无明显影响。加用Apamin(SKCa阻滞剂)、Ch Tx(IKCa阻滞剂)及Glibenclamide(KATP阻滞剂),Emax分别有不同程度地下降;加用Iberiotoxin(BKCa阻滞剂)后,Emax未见明显下降。5血管张力实验结果显示,ACh对CSE-si RNA体内转染大鼠BA、MCA及主动脉的浓度依赖性舒张作用减弱;L-Cys对CSE-si RNA体内转染大鼠BA和MCA的浓度依赖性舒张作用也同样减弱。6缺氧再给氧(OGD/R)可导致内皮细胞生存率降低;Na HS预处理(25~100u M)能够浓度依耐性地减轻OGD/R诱发的细胞死亡和乳酸脱氢酶(LDH)的升高;PPG预处理则加重OGD/R诱发的细胞死亡和LDH的升高。7 OGD/R可导致内皮细胞超氧化歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)降低,活性氧(ROS)增高;Na HS预处理(50u M)能够改善OGD/R诱发的SOD和CAT降低及ROS升高;PPG预处理则加重OGD/R诱发的SOD和CAT降低及ROS升高。8 OGD/R可导致内皮细胞SIRT6表达下调,Na HS(50u M)及TFR(900mg/L)预处理可上调内皮细胞SIRT6的表达。9血管张力实验结果显示,TFR(11~2700 mg/L)可浓度依赖性地舒张大鼠BA和MCA,其Emax分别是65.76±5.84%和67.09±4.93%;加用PPG后,Emax明显下降;TFR对CSE-si RNA体内转染大鼠BA和MCA的浓度依赖性舒张作用同样减弱;TFR对CSE-KO小鼠BA和主动脉的舒张作用消失。10 TFR预孵可增加大鼠脑血管H2S生成量;PPG可抑制TFR的上述作用。11脑缺血再灌注(I/R)可导致大鼠神经功能评分和脑梗死体积百分比增加,脑血管H2S生成量降低,TFR预处理可改善I/R诱发的上述变化;在CSE-si RNA体内转染大鼠,TFR预处理改善I/R诱发的神经功能评分、脑梗死体积百分比增加及脑血管H2S生成量降低的作用减弱。12 I/R可导致小鼠神经功能评分和脑梗死体积百分比增加,脑血管H2S生成量降低,TFR预处理可减轻I/R诱发的上述变化;在CSE-KO小鼠,I/R诱发的上述变化加重;在CSE-KO小鼠上,TFR预处理对I/R诱发的神经功能评分、脑梗死体积百分比增加及脑血管H2S生成量的降低无明显影响。结论:1.内源性H2S参与了ACh诱导的大鼠BA和MCA内皮依赖性的舒张反应;2.外源性H2S可舒张大鼠BA和MCA,其作用涉及SKCa、IKCa和KATP通道;3.外源性H2S对缺氧再给氧诱发的脑血管内皮细胞损伤有保护作用,其作用可能与SIRT6的表达上调有关;4.TFR可舒张大鼠BA和MCA,其作用可能与脑血管内皮细胞中CSE-H2S-SIRT6通路相关;5.TFR具有抗脑缺血再灌注损伤作用,其机制与促进脑血管H2S生成增加有关。