研究背景及目的：在世界范围内，原发性肝癌是最常见的恶性程度最高的肿瘤之一，为全球第5大癌症，死亡率位列第3位。据报道，每年有将近100万人被诊断为肝癌，60万人死于该病，且5年生存率低于5%，并且发病率还在逐年升高，因此肝癌严重威胁着人类的健康和生命。手术治疗、肝移植、肝动脉化疗栓塞术（TACE）、射频消融治疗（RFA）为目前肝癌的主要治疗手段。手术治疗仍是肝癌治疗的首选方法，但是手术后复发仍然是至今无法解决的难题，并且复发率很高。对于合并有肝硬化的肝癌患者，肝移植是最有前景的治疗手段，但由于供体肝短缺，肝移植的开展受到较大限制。由于各治疗手段的局限性，导致肝癌患者的生存率低下，迫切需要结合肝癌的发病机制研究进一步开发新疗法。肿瘤干细胞假说认为在肿瘤组织中存在一种数量较少的肿瘤干细胞，被认为是肿瘤增殖、侵袭、转移及复发的根源。目前在白血病、乳腺癌、肺癌、脑肿瘤、结直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中均已成功分离出肿瘤干细胞。肝癌中存在肿瘤干细胞与其难治、复发及耐药等特点密切相关，而这些特点提示肝癌很可能是一种肿瘤干细胞疾病。随着研究地不断深入，越来越多的肝癌干细胞表面标志物被确立，并应用于干细胞的鉴别与分选，主要包括CD133、CD24、CD44、CD90、上皮细胞黏附分子（EpCAM）等。目前有报道，利用细胞表面分子分离出的肝癌干细胞在复发、耐药等方面发挥着重要作用。方法：本研究通过CD133和CD24两个肿瘤干细胞标志物为筛选标记，从肝癌细胞系Huh-7细胞中分离出CD133+CD24+阳性细胞，在体外从自我更新能力、分化能力、克隆能力及耐药等方面进行了细胞学行为的鉴定，在体内从致瘤性、CD133和CD24蛋白的表达等方面进行了鉴定。1．应用流式细胞术检测CD133、CD24等表面分子在肝癌细胞系的表达情况，并分选和鉴定CD133+CD24+细胞；2．检测CD133+和CD24+细胞克隆形成能力及成球能力；3．利用RT-PCR检测CD133和CD24表达水平；4. Western blot法检检测分选出的细胞基因表达；5．利用小鼠模型检测分选细胞的成瘤能力；6．免疫组织及HE染色检测小鼠肿瘤组织中CD133及CD24的表达；7．MTT检测细胞对洛铂的敏感性。结果：本研究以CD133和CD24为肿瘤干细胞标志物，利用流式细胞分选法从Huh-7细胞中分选出CD133+CD24+细胞和CD133-CD24-细胞，并检测了其成球能力、克隆形成能力、CD133和CD24表达、在体内的成瘤能力及对洛铂的敏感性等，得到以下主要结果：1．肿瘤干细胞标记物CD133和CD24在肝癌细胞系Huh-7呈共表达；2．CD133+CD24+细胞具有很强的克隆形成能力及成球能力；3．与对照组相比，CD133+CD24+细胞明显高表达CD133和CD24基因及蛋白；4.分选出的CD133+CD24+细胞具有更强的致瘤性；5.小鼠移植瘤模型分离出肝癌组织表达CD133和CD24蛋白；6．CD133+CD24+细胞大多处于细胞周期静止期（G0/G1期）；7. CD133+CD24+细胞对洛铂相对耐药，其IC50为9.9μg/mL；结论：1.肝癌细胞系Huh-7同时表达肿瘤干细胞标记CD133和CD242. CD133+CD24+Huh-7细胞具有肿瘤干细胞的特性，包括具有自我更新及分化能力，更强克隆及成球能力，在免疫缺陷小鼠体内具有高致瘤性。3.与CD133-CD24-Huh-7细胞相比，CD133+CD24+Huh-7细胞对洛铂更耐药。总之，联合使用细胞表面分子CD133和CD24可以更好的分选、分离和鉴定肝癌干细胞，分选出的细胞具有高成球能力、高克隆形成能力、高致瘤性和高耐药性。CD133和CD24可以作为分离肝癌干细胞的表面标记物。创新点：CD133和CD24可以作为分选肝癌干细胞的表面标记物，CD133和CD24联合应用能更好地从肝癌细胞系中分离出肝癌干细胞。