研究背景随着人口老龄化、人们饮食结构的改变,全球范围内糖尿病发病率逐年升高,统计数据预测显示2030年全球糖尿病患者将达到3.66亿。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最重要的微血管并发症之一,约30-40%的糖尿病患者会发生DN,是导致终末期肾脏病(End-stage renal disease,ESRD)最主要的病因之一,给家庭及社会带来了极大负担。DN发病机制复杂,治疗措施有限,进一步探索DN的发生、发展机制,具有很大的现实意义。循环和肾脏局部炎症因子的表达异常是促进糖尿病肾病发生发展的重要因素。对糖尿病肾病微炎症状态的调节或许是防治糖尿病肾病的一个有效途径。Tristetraprolin(TTP)是锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP)家族中的一员,可通过与多种炎症因子m RNA的3’端非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)结合,介导炎症因子m RNA的降解,发挥转录后调控作用,被誉为“抗炎蛋白”。文献报道TTP的低表达与代谢综合征及某些肿瘤的发生有关。我们课题组前期研究发现DN患者血、尿中TTP表达降低,与尿蛋白及炎症因子的表达呈负相关。然而,DN环境下肾脏及肾脏细胞TTP的表达及其对DN发生发展的影响,目前没有研究报道。因此,我们通过体内和体外实验研究TTP在DN模型中的表达及活性改变,TTP对于DN发生发展及高糖环境下足细胞损伤的调节作用,初步探讨TTP对DN有无保护作用及其机制。第一部分Tristetraprolin在糖尿病小鼠肾脏的表达及高糖对足细胞中其表达及活性的影响目的观察Tristetraprolin(TTP)及炎症因子IL-6,TNF-α,IL-18在高糖培养的小鼠足细胞及糖尿病模型db/db小鼠肾脏的表达,及高糖环境对TTP活性的影响。方法1.分别使用25mmol/L葡萄糖刺激小鼠足细胞不同时间,荧光定量PCR检测各时间点TTP m RNA的表达情况,western blot检测TTP及细胞表型相关蛋白,ELISA检测IL-6、TNF-α、IL-18的分泌。2.western blot检测10周,14周,18周,22周db/db小鼠及22周db/m小鼠肾皮质TTP、IL-6、TNF-α、IL-18蛋白水平的表达。3.通过RNA-蛋白质免疫沉淀技术,检测高糖环境下小鼠足细胞TTP结合IL-6,TNF-α及IL-18m RNA亲和力的改变,即TTP的活性改变。结果1.与5.6mmol/L葡萄糖培养的小鼠足细胞相比,25mmol/L葡萄糖刺激的小鼠足细胞TTP m RNA和蛋白表达水平均下降,IL-6、TNF-α、IL-18分泌增加,伴随足细胞的表型改变。2.与22周db/m小鼠比较,10周,14周,18周,22周db/db小鼠肾皮质TTP m RNA和蛋白表达水平均下降,IL-6、TNF-α、IL-18表达增加。3.与5.6mmol/L葡萄糖浓度培养的小鼠足细胞相比,高糖环境下(25mmol/L)足细胞TTP对IL-6 m RNA、TNF-αm RNA及IL-18 m RNA结合能力减弱。结论高糖培养的小鼠足细胞及糖尿病模型小鼠肾脏存在TTP与炎症因子表达失衡现象,且高糖环境下足细胞TTP活性降低。第二部分调节Tristetraprolin对高糖导致的足细胞损伤的影响目的通过体外实验研究下调Tristetraprolin(TTP)对于小鼠足细胞的损伤作用,探讨过表达TTP对高糖导致的足细胞损伤有无缓解作用。方法1.利用si RNA下调小鼠足细胞TTP表达,ELISA检测IL-6、TNF-α,IL-18的分泌,western blot检测足细胞标记蛋白nephrin、podocin,上皮间充质细胞标记蛋白α-SMA及转分化诱导因子snail的表达。2.利用过表达TTP慢病毒表达载体上调小鼠足细胞TTP表达,ELISA检测IL-6、TNF-α,IL-18的分泌,western blot检测nephrin、podocin、α-SMA、snail及NF-κB p65的表达。使用试剂盒应用荧光酶标仪检测足细胞ROS活性氧。Transwell白蛋白流入量检测足细胞单层屏障功能。各处理组细胞加入放线菌素D后,使用q RT-PCR检测snail m RNA稳定性,RIP检测TTP与snail m RNA的结合,p NF-κB-Luc双荧光素酶报告基因实验验证NF-κB的反式激活能力。结果1.下调TTP使足细胞IL-6、TNF-α,IL-18的分泌增多,足细胞标记蛋白nephrin、podocin表达减少,转分化标记蛋白α-SMA的表达增多。2.过表达TTP可减轻高糖导致的足细胞炎症因子IL-6,TNF-α,IL-18表达增多,减少ROS活性氧产生,增加nephrin、podocin表达,减少α-SMA、snail表达,减少白蛋白流入量,改善足细胞单层屏障功能,抑制高糖导致的足细胞NF-κB活化。3.TTP与snail m RNA存在结合,过表达TTP可抑制snail m RNA稳定性。结论TTP对于维持足细胞正常生理状态有重要作用,TTP表达减少可导致足细胞表型改变,过表达TTP可减轻高糖导致的足细胞损伤。第三部分上调Tristetraprolin对糖尿病肾病小鼠肾脏损伤的影响目的通过体内实验探讨过表达Tristetraprolin(TTP)对于糖尿病肾病模型db/db小鼠肾脏有无保护作用。方法1.6周龄雄性db/m小鼠和db/db小鼠正常饲养于SPF通风隔离笼,db/db小鼠随机分为3组,8周时予部分db/db小鼠尾静脉注射TTP慢病毒载体及对照载体。14周时重复注射一次。2.每两周检测小鼠体重,血糖,每四周检测尿白蛋白/肌酐,22周时处死小鼠,PAS染色、电镜观察肾脏结构,免疫组化、western blot检测肾脏炎症指标、纤维化指标表达情况,试剂盒检测总SOD活性和MDA含量。结果1.尾静脉注射TTP慢病毒载体有效增加了db/db小鼠肾脏TTP水平,过表达TTP可减少db/db小鼠尿白蛋白排泄,但对体重、血糖无显著影响。2.过表达TTP可显著降低db/db小鼠肾皮质炎症指标、纤维化指标的表达,减轻系膜基质增多、基底膜增厚的程度,改善足细胞足突融合、消失。3.过表达TTP可升高db/db小鼠肾皮质总SOD活性,降低MDA含量,减轻氧化应激反应。结论过表达TTP可延缓db/db小鼠糖尿病肾病的进展,减轻损伤。第四部分高糖环境下Tristetraprolin表达及活性异常发生机制的初步探索目的研究高糖环境下GSK3β对Tristetraprolin(TTP)表达及活性改变的影响。方法1.使用GSK3β抑制剂对小鼠足细胞进行预处理,或使用GSK3βsi RNA转染小鼠足细胞,然后用高糖处理各组细胞48小时,western blot检测TTP、GSK-3β,p-GSK3β的表达,ELISA检测IL-6,TNF-α分泌情况。RIP检测比较各预处理组与高糖组TTP结合TNF-α、IL-6 m RNA亲和力。2.使用突变激活型GSK3β质粒转染正常糖培养的足细胞,western blot检测TTP,GSK-3β,p-GSK3β的表达,RIP检测比较转染组与转染对照组中TTP结合TNF-α、IL-6 m RNA的亲和力。3.免疫共沉淀验证TTP与GSK3β有无直接相互结合。结果1.GSK3β抑制剂、GSK3βsi RNA均能改善高糖导致的足细胞TTP含量降低、结合m RNA的亲和力减弱。2.突变激活型GSK3β可模拟高糖导致的足细胞TTP表达减少及结合m RNA亲和力的降低。3.GSK3β与TTP能够直接结合。结论GSK3β的激活可能参与了高糖导致的足细胞表达及活性降低,而抑制GSK3β可逆转这种改变。全文结论高糖培养的小鼠足细胞及糖尿病模型小鼠肾脏存在Tristetraprolin与炎症因子表达失衡现象,且高糖环境下足细胞Tristetraprolin活性降低。上调Tristetraprolin对高糖培养的足细胞及糖尿病肾病小鼠有保护作用。GSK3β参与了高糖导致的足细胞Tristetraprolin表达及活性改变。