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黑莓(Blackberry),又称黑刺莓,是悬钩子属(Rubus L.)植物中应用于园艺栽培使用的三大种群之一。黑莓果实含有丰富的花青素苷、原花色素以及微量矿质元素,具有较高的营养价值而风靡欧美,被列为世界第三代水果。其果实提取物的抗癌、消炎以及预防心血管疾病等保健功效显著,在病理学方面得到了广泛研究。但有关黑莓果实内含物,尤其是有关花青素苷以及原花色素的生物合成方面报道甚少。国外的黑莓品种选育主要来源于野生资源的筛选,而我国没有黑莓野生群体分布,主栽品种均引白国外。因此,应用分子生物学手段对引进的黑莓品种进行遗传改良以培育具有自主知识产权的黑莓品种,在我国黑莓育种工作中具有良好的发展前景。本课题从黑莓果实发育过程中的花青素苷和原花色素生理变化入手,克隆获得了类黄酮代谢途径中花青素苷和原花色素分支的6个关键结构基因和控制花青素苷合成的1个转录调节因子基因,并分析了这些基因在黑莓果实发育过程中的表达变化。主要研究内容和结果如下：1分别采用了pH示差法和DMACA化学反应法对黑莓果实发育过程中的花青素苷和原花色素进行测定。结果表明：成熟的黑莓果实中含有丰富的花青素苷(1.426mg-g-1FW)。在果实发育的前期,花青素苷含量较低,而在果实发育的后期,即红色转为黑色过程中花青素苷大量积累。但幼嫩的果实中原花色素含量较高(>40mg-g-1FW),随着果实的成熟,原花色素含量逐渐减少,到果实成熟时原花色素含量达到最低值(4.12mg-g-1FW)。2通过同源克隆的方式获得了黑莓类黄酮代谢的花青素苷和原花色素合成途径中的6个关键结构基因,包括查尔酮合成酶(Rubus Chalcone Synthase, RuCHS, Accession No. JN602374)、二氢黄酮醇4-还原酶(Rubus Dihydroflavonol4-reductase, RuDFR, Accession No. JF764809),无色花青素双加氧酶(也称花青素合成酶)(Rubus Leucoanthocyanidin dioxygenase, RuLDOX/ANS, Accession No. JF764807)、无色花青素还原酶(Rubus Leucoanthocyanidin Reductase, RuLAR, Accession No. JQ068826)和花青素还原酶(Rubus Anthocyanidin Reductase, RuANR, Accession No. JQ068825)以及一个糖基转移酶(Glycosyltransferase) RuGT1(Accession No. JF764808)编码基因。3以黑莓基因组DNA为模板,同源克隆获得了RuMYB10基因片段,通过SON-PCR技术获得了该基因全长编码序列(Full Coding Sequences, CDS);以黑莓果实mRNA为模板,RT-PCR扩增获得了基因全长(Accession No.:JQ359611)。序列分析表明：该基因全长编码区共1837bp,编码216个氨基酸,分子量为24863Da。具有MYB转录因子家族特有的R1R2保守序列。与悬钩子属的欧洲红树莓(Rubus ideaus) RiMYB10相比,两者内含子区变异极大,但氨基酸具有较高的同源性(89.81%)。在RuMYB10基因的两个内含子中,第二个内含子长度为750bp,占全长40.8%；在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的’[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。4采用改进的CTAB法获得了黑莓果实高质量RNA,用实时定量PCR技术对各结构基因以及调控基因RuMYB10在黑莓果实发育过程中的表达变化进行分析。结果表明：调控花青素苷合成的结构基因RuANS表达变化与花青素苷合成积累-致,在其果实红色到黑色转色过程中达到最高水平；而原花色素合成途径中的特异基因RuLAR和RuANR在幼果期表达量最高,伴随着原花色素的减少,转录水平也呈下降趋势；而作为类黄酮代谢前期以及中期的结构基因RuCHS和RuDFR,其前期有一个转录增加的过程,到果实变红之前达到最大值；而后转录水平逐渐降低,直到花青素苷大量积累的果实变黑阶段又有一个转录增加的过程。作为花青素苷合成代谢的特异调控因子,RuMYB10基因表达模式与RuANS基因类似,在花青素积累高峰来临之前达到最高表达量,从而验证了该因子调控作用的特异性。相关性分析表明,RuANS是黑莓花青素苷合成途径中的特异酶,而相对于RuANR, RuLAR和黑莓原花色素的积累关系更为密切。5采用简并引物扩增所获得的RuGT糖基转移酶可能是一个原花色素合成相关的糖基转移酶(Glycosyltransferases, GTs)家族成员。同已报道的其他类黄酮糖基转移酶具有较高的同源性。其转录水平在幼果期最高,随着果实的发育而逐渐降低,直到果实大量积累花青素苷时才有小幅回升。此模式与以往报道的类黄酮糖基转移酶截然不同,而与新近报道的原花色素特异糖基转移酶基因(?)JGT72L1表达模式类似。其底物特异性及酶促动力学特征正在作进一步研究。