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研究背景目前,胰岛β细胞功能发生障碍的机制还不十分清楚。已知β细胞在葡萄糖刺激胰岛素分泌的过程中,钙离子内流引起细胞内钙离子的变化在细胞信号转导中处于中心地位。但是,在高糖作用下,胰岛β细胞功能发生障碍的过程中,胞内钙离子的变化机理如何,目前尚无定论。葡萄糖诱发的胰岛β细胞内钙升高的现象首先发生在细胞膜附近的周边部位,然后扩散至整个胞浆。钙离子内流的瞬间形成细胞膜附近局部的高钙现象,L型Ca2+通道占β细胞钙通道的60%以上,并与胰岛素分泌颗粒存在着空间上的紧密联系。这些微观上的生理结构排列将钙内流引起的最大钙水平限制于细胞发生胞裂外排的局部区域,近膜区的钙离子浓度在葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程可能比胞质钙起更重要的作用。但以往研究由于实验条件的限制难以明确近膜钙定位,多以细胞质的平均钙离子浓度表示,目前尚未见到有关胰岛β细胞近膜钙浓度梯度的变化与胰岛素分泌相互关系的报告。本研究以含不同浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液孵育原代培养大鼠β细胞,检测β细胞胞质钙、近膜钙和胰岛素分泌的变化,探讨葡萄糖与胞质钙、近膜钙和胰岛素分泌的关系。目的探索建立β细胞近细胞膜钙离子的测定技术,建立同步测定β细胞近膜钙离子和胞质钙离子的方法;以含不同浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液孵育原代培养大鼠β细胞,检测β细胞胞质钙、近膜钙和胰岛素分泌的变化,探讨葡萄糖与胞质钙、近膜钙和胰岛素分泌的关系,为进一步研究高糖引起的胰岛β细胞功能障碍的发生机制奠定基础。方法雄性SD大鼠胰腺胆总管逆行灌注Ⅴ型胶原酶消化、histopaque-1077纯化获得胰岛,胰酶逐级消化胰岛,分离出β细胞;近膜钙离子荧光探针FFP-18/AM负载β细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜技术（laser scanning confocal microscopy,LSCM）测定β细胞近膜钙离子的分布和变化;分别用近膜钙离子荧光探针FFP-18/AM和胞质钙离子荧光探针Fluo-3/AM同时负载β细胞,同步测定β细胞近膜钙离子和胞质钙离子浓度的变化;分别用含5.6, 8.3, 11.1, 16.7和33.3mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培养液对原代培养大鼠β细胞孵育0、30、60、120和240 min后（n=8）,利用LSCM观察同时负载FFP-18/AM、Fluo-3/AM的β细胞近膜钙、胞质钙的变化,收集细胞上清液检测胰岛素分泌的变化。结果1.胶原酶Ⅴ消化分离获得直径在100-300μm之间的胰岛约为（337.80±21.36）/胰腺,给予16.7mmol/L葡萄糖刺激1h后,胰岛素分泌迅速从（25.76±1.53）μU/mL增加到（151.71±5.80）μU/mL （P﹤0.01）,分离的单个细胞免疫荧光染色鉴定证实β细胞纯度约为70%;从而获得了用于实验的活性良好的单个β细胞。2. FFP-18/AM负载β细胞后,激光扫描共聚焦显微镜检测显示:在340 nm紫外光激发下,大部分荧光信号来自质膜内侧面,呈蓝色荧光,主要分布在细胞膜附近,反映了质膜附近的钙离子浓度。其分布呈不均匀性,近膜钙离子荧光强度立体示意图示,荧光所在位置显示所测定钙离子在细胞膜附近,荧光峰显示细胞膜不同部位的荧光强度强弱不等,即近膜钙离子的分布具有不均匀性。β细胞被16.7mmol/L葡萄糖刺激后,10s内近膜钙水平迅速升高,从基线值（938.04±74.38）升高至（1259.93±123.03）,与基线相比显著增加（P﹤0.01）。3.β细胞被Fluo-3/AM负载后,激光扫描共聚焦荧光信号来自整个细胞质,呈绿色荧光,反映了全细胞质的[Ca2+];细胞膜内面FFP-18/AM同时负载显示蓝色荧光,反映了细胞膜附近的[Ca2+];而在近膜区两种钙离子浓度信号重叠则产生青色荧光。初步建立了β细胞近膜钙离子和胞质钙离子的同步测定方法。4.原代培养大鼠β细胞在含5.6、8.3、11.1、16.7和33.3mmol/L浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液中分别孵育0、30、60、120和240 min后,近膜钙水平变化结果显示:5.6mmol/L葡萄糖孵育组0, 30,60, 120和240 min近膜钙水平分别为:（609.84±72.65）、（607.20±69.31）、（608.33±82.75）、（634.76±46.34）、（646.59±81.53）,各时间点均无差异（P>0.05）;8.3mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min近膜钙水平分别为:（608.84±32.63）、（657.50±37.41）、（753.33±17.44）、（780.87±46.07）、（798.45±17.73）,方差分析及LSD-t检验示5个时间点近膜钙水平两两比较均有显著性差异（P<0.01）,近膜钙水平随孵育时间的延长明显升高（P<0.01）;11.1mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min近膜钙水平分别为:（609.21±42.35）、（758.03±28.16）、（831.81±39.60）、（946.51±26.68）、（1001.54±51.04）,方差分析及LSD-t检验示5个时间点近膜钙水平两两比较均有显著性差异（P<0.01）,近膜钙水平随孵育时间的延长明显升高（P<0.01）;16.7mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min近膜钙水平分别为:（ 610.64±62.68 ）、（ 844.981±35.13 ）、（1148.52±77.49）、（1235.32±33.82）、（1375.00±39.76）,方差分析及LSD-t检验示5个时间点近膜钙水平两两比较均有显著性差异（P<0.01）,近膜钙水平随孵育时间的延长明显升高（P<0.01）;33.3mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min近膜钙水平分别为:（ 609.64±52.65 ）、（ 1211.41±28.33 ）、（ 1267.49±25.15 ）、（ 1303.57±23.20 ）、（1573.25±39.21）,方差分析及LSD-t检验示5个时间点近膜钙水平两两比较均有显著性差异（P<0.01）,近膜钙水平随孵育时间的延长明显升高（P<0.01）。近膜钙水平组间比较,方差分析及LSD-t检验示:除0min外,在每个时间点上,5组间近膜钙水平两两比较均存在差异（P<0.01）,各组间的近膜钙水平在每个时间点上均随孵育的葡萄糖浓度升高而显著的增加（P<0.01）。5.原代培养大鼠β细胞在含5.6、8.3、11.1、16.7和33.3mmol/L浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液中分别孵育0、30、60、120和240 min后,胞质钙水平变化结果显示:5.6mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胞质钙水平分别为:（398.92±42.96）、（383.79±32.17）、（399.56±15.69）、（383.50±36.51）、（393.50±34.21）,各时间点均无差异（P>0.05）;8.3mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胞质钙水平分别为:（398.92±42.96）、（451.29±9.80）、（509.99±7.04）、（534.22±16.40）、（646.00±13.88）,方差分析及LSD-t检验示各时间点两两比较均有显著性差异（P<0.01）;11.1mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胞质钙水平分别为:（398.92±42.96）、（607.86±10.47）、（616.54±24.82）、（724.98±25.94）、（751.63±37.91）,方差分析及LSD-t检验示30min比0min胞质钙离子水平明显升高（P<0.01）,30min和60min间胞质钙离子水平无差异（P>0.05）,其余各时间点两两比较胞质钙离子水平均有显著性差异（P<0.01）;16.7mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胞质钙水平分别为:（398.92±42.96）、（696.97±14.75）、（708.26±28.65）、（830.92±23.70）、（870.492±22.51）,方差分析及LSD-t检验示30min比0min胞质钙离子水平明显升高（P<0.01）,30min和60min间胞质钙离子水平无差异（P>0.05）,其余各时间点两两比较胞质钙离子水平均有显著性差异（P<0.01）;33.3mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胞质钙水平分别为:（398.92±42.96）、（955.41±33.96）、（1069.94±38.26）、（1123.40±33.14）、（1307.96±55.38）,方差分析及LSD-t检验示各时间点两两比较均有显著性差异（P<0.01）。胞质钙水平组间比较,方差分析及LSD-t检验示:除0min外,在每个时间点上,5组间胞质钙水平两两比较均存在差异（P<0.01）,各组间的胞质钙水平在每个时间点上均随孵育的葡萄糖浓度升高而显著的增加（P<0.01）。6.原代培养大鼠β细胞在含5.6、8.3、11.1、16.7和33.3mmol/L浓度葡萄糖的RPMI 1640培养液中分别孵育0、30、60、120和240 min后,结果显示:5.6mmol/L葡萄糖孵育组0, 30,60, 120和240 min胰岛素水平分别为:（25.24±3.23）、（24.73±1.99）、（25.32±2.49）、（26.09±1.60）、（27.02±1.55）μU/mL,各时间点胰岛素分泌无差异（P>0.05）;8.3mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胰岛素水平分别为:（25.24±3.23）、（42.26±4.67）、（89.25±2.95）、（120.29±4.46）、（125.92±3.20）μU/mL,方差分析及LSD-t检验示120 min和240min的胰岛素分泌无显著差异（P>0.05）,其余各时间点胰岛素分泌两两比较均有显著性差异（P<0.01）;11.1mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胰岛素水平分别为:（25.24±3.23）、（80.71±4.63）、（125.83±2.56）、（146.99±3.17）、（149.85±6.11）μU/mL,方差分析及LSD-t检验示120 min和240min的胰岛素分泌无显著差异（P>0.05）,其余各时间点胰岛素分泌两两比较均有显著性差异（P<0.01）;16.7mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胰岛素水平分别为:（25.24±3.23）、（98.52±2.52）、（156.11±5.95）、（163.14±3.08）、（166.17±4.85）μU/mL,方差分析及LSD-t检验示120 min和240min的胰岛素分泌无显著差异（P>0.05）,其余各时间点胰岛素分泌两两比较均有显著性差异（P<0.01）;33.3mmol/L葡萄糖孵育组0、30、60、120和240 min胰岛素水平分别为:（25.24±3.23）、（105.92±4.66）、（169.49±2.88）、（181.27±4.62）、（184.94±7.51）μU/mL,方差分析及LSD-t检验示120 min和240min的胰岛素分泌无显著差异（P>0.05）,其余各时间点胰岛素分泌两两比较均有显著性差异（P<0.01）。5组含不同浓度葡萄糖的培养液孵育胰岛β细胞分泌的胰岛素浓度组间行方差分析及LSD-t检验比较示:除0min外,在每个时间点上,各组间胰岛素浓度两两比较均存在显著差异（P<0.01）,各组间的胰岛素浓度在每个时间点上均随孵育的葡萄糖浓度升高而明显的增加（P<0.01）。结论1.初步建立β细胞近膜钙离子测定技术,建立了β细胞近膜区钙离子和全胞质钙离子的同步测定方法。2、随葡萄糖浓度的升高,近膜钙、胞质钙水平随之升高,同时胰岛素分泌量同步增加,提示胰岛素分泌与近膜钙和胞质钙水平有关。