【摘 要】
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背景:由于卫星细胞的存在,骨骼肌在受伤时具有显著的再生能力。卫星细胞自我更新是由配对盒蛋白7（PAX7）驱动的,配对盒蛋白7（PAX7）是在肌发生中起重要作用的转录因子。卫星细胞的维持和功能受昼夜节律调节。Cryptocrhome 2（CRY2）是生物钟的关键组成部分,其在骨骼肌再生中的作用仍存在争议。目的:本研究旨在探究CRY2对卫星细胞的功能以及骨骼肌再生的作用。方法:（1）对野生型C57小鼠
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背景:由于卫星细胞的存在,骨骼肌在受伤时具有显著的再生能力。卫星细胞自我更新是由配对盒蛋白7（PAX7）驱动的,配对盒蛋白7（PAX7）是在肌发生中起重要作用的转录因子。卫星细胞的维持和功能受昼夜节律调节。Cryptocrhome 2（CRY2）是生物钟的关键组成部分,其在骨骼肌再生中的作用仍存在争议。目的:本研究旨在探究CRY2对卫星细胞的功能以及骨骼肌再生的作用。方法:（1）对野生型C57小鼠的胫骨前肌进行组织切片和分离小鼠的卫星细胞,通过免疫荧光染色和体外分化实验,探究在卫星细胞中CRY2是否表达以及表达位置,同时通过western blot和Q-PCR检测随着肌源性分化的进行CRY2表达量的变化。（2）利用Cre/loxP系统构建CRY2骨骼肌卫星细胞特异性敲除的小鼠（CRY2scko小鼠）和同窝对照组小鼠（CRY2flox/flox小鼠）,通过对小鼠的胫骨前肌注射BaCl2溶液构建肌肉损伤模型,运用HE染色、免疫荧光染色、western blot和Q-PCR等技术探究CRY2在卫星细胞中特异性缺失后对受损伤肌肉肌再生的影响。（3）通过免疫荧光染色、western blot和Q-PCR等实验技术,探究CRY2在卫星细胞中特异性缺失后,肌肉中PAX7+卫星细胞数量以及PAX7表达量的变化。（4）分离CRY2scko小鼠和CRY2flox/flox小鼠的单根肌纤维,在体外培养0小时和体外培养72小时后对肌纤维进行PAX7和MyoD染色,探究CRY2的缺失是否影响了卫星细胞的自我更新能力。（5）分离CRY2scko小鼠和CRY2flox/flox小鼠的卫星细胞,通过卫星细胞分化实验、增殖实验、集落实验等,探究CRY2缺失后对卫星细胞分化、增殖以及PAX7表达的影响。（6）对CRY2scko小鼠和CRY2flox/flox小鼠的腓肠肌进行RNAseq,对RNAseq的结果进行GO分析和KEGG分析。通过western blot和ChIP实验,探究CRY2缺失后是否通过活化MAPK信号通路来活化转录因子ETS1进而影响PAX7的表达。（7）构建缺血-再灌注肌肉损伤模型,通过卫星细胞移植实验和细胞凋亡实验来探究CRY2的缺失是否对卫星细胞在缺血再灌注损伤环境下的的存活及凋亡产生影响。（8）构建X射线辐射损伤模型,探究CRY2在小鼠卫星细胞中特异性缺失后是否对辐射损伤起到保护作用。结果:我们的结果表明,CRY2在卫星细胞的细胞核和细胞质中均表达,并且在分化过程中其表达逐渐增加。接下来我们构建了卫星细胞特异性CRY2基因敲除小鼠（CRY2scko）进行实验,我们的实验结果表明CRY2的缺失增强了肌肉再生,这可以通过eMyHC的表达增加,PAX7+卫星细胞的数量增加和PAX7的表达上升来证明。单根肌纤维分析表明,CRY2缺失导致卫星细胞的自我更新能力的增强。我们的细胞体外增殖和分化实验表明,CRY2的缺失会促进卫星细胞的增殖而不影响分化。对来自RNAseq结果的上调基因的GO分析显示,CRY2缺失后对ERK1/2和JNK级联有正调节作用,表明CRY2的缺失导致MAPK信号通路的激活。我们的RNAseq数据显示转录因子ETS1是ERK1/2的下游靶标。ChIP分析显示,WT野生型小鼠卫星细胞的PAX7启动子区域有2个ETS1的结合位点,与对照相比,从CRY2scko小鼠中分离的卫星细胞中ETS1的富集倍数显着增加。这些数据表明,CRY2的缺失增强了转录因子ETS1与PAX7启动子的结合。此外,我们证明了 CRY2-/-原代成肌细胞中p-ETS1蛋白水平增加,而ERK1/2或JNK1/2抑制剂则消除了这种增加。这些结果证实,CRY2缺失导致ERK1/2和JNK1/2的磷酸化增加,从而使ETS1磷酸化,进而诱导PAX7转录。在缺血-再灌注损伤模型中,CRY2-/-原代成肌细胞在受伤肌肉中的存活率显着高于对照组。CRY2scko小鼠辐照后的肌肉卫星细胞数量高于对照组,而纤维化程度则低于对照组。结论:我们的研究发现了 CRY2在调节卫星细胞功能中的未知作用。CRY2缺失通过通过激活ERK1/2/JNK1/2/ETS1信号通路上调PAX7来增强卫星细胞的自我更新。CRY2的下调对于维持卫星细胞干细胞库以维持骨骼肌对于重复性损伤的再生潜力是必要的。这些发现为促进肌肉再生的新治疗方法的发展铺平了道路。
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