研究背景和目的黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于自然界中的一类重要的天然有机化合物,许多食物例如水果、蔬菜和药材中都含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有广泛的药理作用,主要包括对心血管的作用,对消化系统的作用,对呼吸系统的作用,抗炎抗免疫作用,雌激素样作用,镇痛作用,抗肿瘤作用及对酶的影响等。尽管黄酮类化合物对人体的健康十分有益,其在人体内较低的生物利用度(基本上小于5%)却制约了黄酮类化合物的充分利用。研究表明,黄酮类化合物生物利用度低的主要原因是由于其在体内存在广泛的Ⅱ相代谢,这些Ⅱ相代谢产物随后被生物体的外排转运蛋白迅速排出细胞外,从而造成机体内可被利用的黄酮来化合物的量极少。研究黄酮类化合物的吸收、分布、代谢、排泄(ADME),尤其是从代谢环节出发,研究黄酮类化合物Ⅱ相反应的代谢机理,并研究其与药物外排转运蛋白之间的相互作用,是改善黄酮类化合物在机体内生物利用度的关键因素。黄酮类化合物的Ⅱ相代谢方式主要是葡萄糖醛酸化代谢和硫酸化代谢。由于黄酮类化合物的硫酸化代谢产物极难在生物体液中检测出,因此过去的研究多数侧重于黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢,而对硫酸化代谢反应在黄酮类化合物代谢中的重要性则研究较少本研究从黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化与硫酸化代谢反应出发,选择黄酮类化合物作为研究对象,考察结构相似而羟基取代位置不同的几种黄酮类化合物,在FVB小鼠肠道S9中葡萄糖醛酸化与硫酸化反应是否存在相互竞争／协同关系；研究黄酮类化合物在人肝S9与C57小鼠肝脏S9中的葡萄糖醛酸化与硫酸化反应特征,考察黄酮类化合物的Ⅱ相代谢反应在不同种属间是否存在差异。同时,考虑到药物外排转运蛋白在黄酮类化合物的代谢过程中具有不可忽视的作用,我们选择生物体内分布最广、具有底物最多的P-糖蛋白(P-gp),考察黄酮类化合物对人结肠癌细胞LS174T细胞内P-gp的表达及活性的影响,从而进一步解释黄酮类化合物的结构与其代谢特征及药理活性之间的关系。方法1.为考察参与黄酮类化合物Ⅱ相代谢的药物代谢酶Ugts和Sults在黄酮代谢过程中是否存在协同或竞争关系,以及这两种代谢酶对黄酮类化合物的结构是否存在选择性和专属型,选择7种化学结构相似的黄酮类化合物,5-羟基黄酮(5-HF),6-羟基黄酮(6-HF),7-羟基黄酮(7-HF),5,6-二羟基黄酮(5,6-diHF),5,7-二羟基黄酮(5,7-diHF),6,7-二羟基黄酮(6,7-diHF)和5,6,7。三羟基黄酮(5,6,7-THF)作为研究对象,建立FVB小鼠在体肠灌流模型和三种FVB小鼠小肠S9体外孵育酶反应体系。小鼠的在体肠灌流模型由已经运用成熟的大鼠在体肠灌流模型改造而来。大鼠在体单向肠灌流实验是在手术后动物处于完全麻醉的状态下进行的,此模型有效地对应于人体空肠灌流模型。对于黄酮类化合物的Ⅱ相代谢反应,大鼠肠灌流模型只能检测到黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢产物,而较难检测出其硫酸化代谢产物,这使得该模型难以模拟黄酮类化合物在人体肠道内的硫酸化代谢反应,而小鼠肠灌流模型则可以解决此问题。考察实验所选的黄酮类化合物在小鼠小肠与结肠部位的葡萄糖醛酸化与硫酸化代谢产物在灌流过程中的排出速率,可以1)比较羟基取代位置不同的黄酮类化合物发生Ⅱ相代谢的反应特征,如Ugts和Sults代谢酶对黄酮类化合物的不同位置的羟基是否有选择性和专属性；2)比较黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢反应和硫酸化代谢反应在小鼠不同部位肠道(小肠与结肠)是否存在不同的代谢产物外排速率,推测小鼠小肠和结肠所含药物代谢酶有无不同；3)比较黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化代谢反应和硫酸化代谢反应在小鼠不同部位肠道(小肠与结肠)是否存在不同的代谢产物外排速率,推测小鼠小肠和结肠所含药物外排蛋白有无不同。建立三种黄酮类化合物在FVB小鼠小肠S9中的体外孵育酶反应体系：1)黄酮类化合物在小肠S9中硫酸化代谢单独反应体系。体系中,小肠S9提供药物发生反应所需的硫酸基团转移酶,PAPS为药物发生结合的硫酸基团供体,KPI缓冲液为药物发生结合反应的缓冲体系,整个体系模拟生物体温度于37℃下水浴进行。反应一定时间后,在反应体系中加入反应终止液终止反应进行,处理样品并进行UPLC分析,测定反应体系中剩余的黄酮类化合物原型药物及产生的代谢产物量,计算单位时间内单位酶浓度黄酮类化合物所产生的代谢产物量为药物的代谢反应速率。随行进行空白对照反应。2)黄酮类化合物在小肠S9中的葡萄糖醛酸化代谢单独反应体系。参考黄酮类化合物硫酸化代谢反应体系,改变反应体系中的硫酸基团供体PAPS为葡萄糖醛酸基团供体UDPGA,并根据药物反应速率改变反应所需的时间和S9中酶浓度,其他条件与操作维持不变,计算单位时间内单位酶浓度黄酮类化合物所产生的葡萄糖醛酸化代谢产物量为药物发生葡萄糖醛酸化代谢反应的速率。3)黄酮类化合物在小肠S9中的硫酸化与葡萄糖醛酸化联合反应体系。参考上述两种反应体系,在S9反应体系中同时为黄酮类化合物提供硫酸基团与葡萄糖醛酸基团的供体,并调节反应时间与酶浓度以达到药物分析测定的要求,其他条件与操作维持不变,分别计算黄酮类化合物发生硫酸化代谢与葡萄糖醛酸化代谢反应的速率,并将之与单独反应体系中计算出的反应速率比较,比较硫酸化代谢反应与葡萄糖醛酸化代谢反应在单独反应体系与联合反应体系中的异同。将小鼠灌流实验中所获得的黄酮类化合物硫酸化代谢产物与葡萄糖醛酸化代谢产物在肠道内的排出速率与体外S9孵育实验获得的两种代谢反应产物的生成速率进行拟合,比较体外反应模型是否与在体实验所获得的结果一致,并分析其原因。2.选择4种单羟基黄酮,3-羟基黄酮(3-HF),5-羟基黄酮(5-HF),7-羟基黄酮(7-HF)和4’-羟基黄酮(4’-HF),3种双羟基黄酮,3,5-二羟基黄酮(3,5-diHF),3,4j-二羟基黄酮(3,4’-diHF)和3,7-二羟基黄酮(3,7-diHF),采用肝脏S9孵育模型,考察黄酮类化合物在体外人肝S9中的葡萄糖醛酸化与硫酸化代谢特征。同时,采用C57小鼠肝脏S9孵育模型,比较黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化和硫酸化在人肝S9与小鼠肝脏S9中的代谢特征是否存在种属间差异。采用C57小鼠肠灌流模型与C57小鼠S9孵育模型,考察黄酮类化合物分别在在体肠灌流与体外S9孵育模型中的葡萄糖醛酸化与硫酸化代谢反应特征,将黄酮类化合物在肠灌流模型中代谢产物的排出速率与体外孵育模型中葡萄糖醛酸化与硫酸化代谢产物的生成速率进行比较,并计算体内外反应的相关系数。3.为考察黄酮类化合物对介导药物在肠道外排与转运的重要转运蛋白P-gp的表达和活性是否有影响,选择5,7-diHF和5,6,7-THF,采用LS174T细胞模型,用以上黄酮类化合物处理人结肠癌细胞LS174T细胞6天以上,并用蛋白免疫印迹法(Western Blot)测定细胞内的P-gp蛋白在药物处理前后的表达量变化。结果1.考察FVB小鼠小肠S9中7种所试黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化与硫酸化反应特征。每个黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化硫酸化反应均考察3个不同浓度(10,20,和40μM)。其中,20gM浓度下各黄酮类化合物的反应速率用于描述其反应特征。结果显示,无论是葡萄糖醛酸化反应还是硫酸化反应,结构中带有7-OH的黄酮类化合物,其7-OH位将优先于其他位置的羟基发生葡萄糖醛酸化与硫酸化结合反应。当黄酮类化合物结构中不含7-OH时,对单羟基黄酮,其结合反应只发生在羟基位置,而对双羟基黄酮如5,6-diHF,则5-位和6-位均有可能发生结合反应。其发生结合反应的速率没有显著性差异。在FVB小鼠小肠S9中的硫酸化结合反应中,各黄酮类化合物在20μM浓度下反应速率最大者为6,7-diHF(反应产物为7-O-S),同时6,7-diHF的硫酸化结合反应在相应的小肠灌流实验中其代谢产物的排出速率也是最快的。对葡萄糖醛酸化结合反应,其反应速率最大者为5,6,7-THF(反应产物为7-O-G)。单独反应系统中的反应速率与硫酸化与葡糖醛酸化联合反应体系中的硫酸化反应速率的差异有统计学意义,联合反应体系中的硫酸化反应速率有显著提高(每个实验黄酮在10、20、40μM浓度下,t检验结果均P<0.05),且7种黄酮类化合物的反应速率的快慢顺序也有改变。而葡糖醛酸化反应的反应速率则与单独反应体系的速率基本一致。小鼠肠灌流模型考察的6种黄酮类化合物,在小肠的葡糖醛酸化代谢产物与硫酸化代谢产物的排出速率均显著大于相应产物在结肠的排出速率(P<0.05),暗示小肠与结肠所含有的Ugts和Sults酶量或者外排转运蛋白量存在差异。在小肠中,除6,7-diHF外,黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化结合产物的排出速率与硫酸化结合产物的排出速率存在统计学差异,且显著大于相应昔元的硫酸化结合产物的排出速率(P<0.05)；而在结肠中,黄酮类化合物的硫酸化结合产物的排出速率与相应的葡萄糖醛酸化产物的排出速率有统计学差异,各黄酮的硫酸化结合产物的排出速率显著大于相应苷元的葡萄糖醛酸化产物的排出速率(P<0.05),说明在小鼠的结肠中,硫酸化代谢反应是比葡糖醛酸化代谢反应更重要的代谢形式。比较所试黄酮类化合物FVB小鼠肠灌流实验中小肠部位与在FVB小鼠小肠S9体外孵育实验所获得的葡萄糖醛酸化反应与硫酸化反应特征,我们发现,体外孵育反应并不能很好的模拟黄酮类化合物在小鼠体内的代谢反应。经计算,体外实验的硫酸化反应速率与在体灌流实验的硫酸化反应速率的相关系数为0.6767。然而,对于葡萄糖醛酸化结合反应来说,体外模拟实验与在体灌流实验之间不存在显著相关性。这可能与整体动物肠道中存在的外排转运蛋白有关。2.考察3-HF,5-HF,7-HF,4’-HF,3,5-diHF,3,4’-diHF和3,7-diHF在人肝S9、C57小鼠肝脏和小肠S9孵育体系中的葡萄糖醛酸化与硫酸化反应特征。每个黄酮类苷元的葡萄糖醛酸化硫酸化反应均考察3个不同浓度(5,10,和40μM)。其中,10μM浓度下各黄酮类化合物的反应速率用于描述其反应特征。结果显示,在七个黄酮类化合物中,葡萄糖醛酸化与硫酸化反应均较易发生在7-OH和4’-OH位置,而3-OH位则不会发生硫酸化反应。比较人与小鼠s9中的硫酸化与葡萄糖醛酸化反应的种属差异,结果表明,七种单羟基黄酮与双羟基黄酮在人肝S9与C57小鼠肝脏S9中的葡萄糖醛酸化与硫酸化反应速率存在种属差异,且差异具有统计学意义(P<0.05)。七个黄酮类化合物中,硫酸转移酶活性最高在人肝S9中。同时,人肝S9中3,7-diHF生成7-O-G的葡萄糖醛酸化反应速率几乎是C57小鼠肝S9中的7-40倍。相反的,人肝S9中4’-HF的葡萄糖醛酸化反应速率则较C57小鼠肝脏S9中低。这种现象说明种属差异会因底物化合物的羟基取代位置不同而有所不同。将黄酮类化合物在C57小鼠肠灌流模型中代谢产物的排出速率与体外孵育模型中葡萄糖醛酸化与硫酸化代谢产物的生成速率进行比较,结果显示,硫酸化代谢产物的体内排出速率与其在体外S9中生成速率的相关系数为0.9834。同时,小肠中黄酮类化合物葡萄糖醛酸化代谢产物的排出速率与体外小肠S9中生成速率也具有较弱相关性(相关系数为0.7988)。3. Western blot实验结果表明,5,7-diHF和5,6,7-THF在处理人结肠癌LS174T细胞6天后,5,7-diHF与5,6,7-THF影响后的细胞与对照组细胞的P-gp表达存在统计学差异(P<0.05),5,7-diHF在10μM (t=4.805, P=0.041)和20μM(t=6.315,P=0.024)浓度下可抑制P-gp表达,而5,6,7-THF在50μM浓度(t=-4.473,P=0.047)下可测得细胞内P-gp蛋白表达显著升高。结论黄酮类化合物结构中的细小差别将对其的硫酸化与葡萄糖醛酸化代谢通路产生显著性影响。小鼠小肠S9中的磺酸转移酶和葡萄糖醛酸转移酶催化黄酮类化合物结构中7-位羟基发生反应的速率要高于其他位置的羟基。黄酮类化合物的葡萄糖醛酸化与硫酸化反应速率在人肝S9与C57小鼠肝脏S9中存在统计学差异,且磺酸转移酶在人肝S9中的活性显著高于C57小鼠肝脏S9。黄酮类化合物对人结肠癌细胞LS174T细胞的P-gp的蛋白表达有一定程度的影响。