目的：　　肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和死亡率已跃居各类恶性肿瘤的首位，而非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的75-80％。目前肺癌的治疗效果及肺癌患者的长期生存率仍不尽人意。肺癌发展进程中多种因子的激活、抑制、相互协同或拮抗均对肺癌的发生和转移产生影响。因此，寻找肺癌发生、转移过程中的有用的生物学标记物，揭示肺癌新的治疗靶点是目前肿瘤分子生物学研究的热点。　　E3泛素连接酶能够调节多种细胞功能，如细胞增殖、细胞周期阻滞和细胞凋亡等。一些E3泛素连接酶及其相关的泛素网的失调通常与人类疾病有关，特别是肿瘤和神经退行性疾病。E3泛素连接酶可以是癌基因，也可以是抑癌基因，主要取决于它们所降解的靶蛋白是抑癌蛋白还是促癌蛋白。许多含有RING-finger结构域的蛋白都拥有泛素连接酶活性，其中有些参与了肿瘤的生成和转移。　　RNF146(RING finger protein146)基因定位于人类染色体6q22，33上。其蛋白含有WWE和N末端RING finger结构域，被鉴定是一种E3泛素连接酶。研究发现，RNF146通过与PAR结合而抑制Parthanators，具有神经保护作用。RNF146还能够促进DNA修复，防止DNA损伤性药物或γ射线诱导的细胞死亡。在细胞损伤之后，RNF146能转移到核内，促进参与DNA损伤修复的各种核蛋白的泛素化和降解。更重要的是，RNF146能够作为PAR核糖基化调控下的E3泛素连接酶，调节tankyrase依赖的axin的降解，从而正向调节Wnt信号通路。　　Wnt信号转导通路与肺癌的转移、扩散、复发密切相关，是在肺癌细胞和已扩散肺癌细胞中保持高活性的通路。Wnt信号转导通路激活后可增加肺癌细胞转移和增殖的能力。Wnt通路可以通过多种机制异常活化，其主要功能是抑制磷酸化调控下的β-catenin的蛋白水解。从APC/Axin/GSK-3β/β-catenin降解复合体中被释放的β-catenin能够进入细胞核，激活Wnt的靶基因。在这一过程中Axin作为一种构架蛋白参与β-catenin降解复合体的形成，其稳定性至关重要。Tankyrase(PARP5)能够催化PAR转移至Axin的残基上，导致Axin的PAR核糖基化。RNF146能够通过自身的PAR结合域与PAR核糖基化的Axin结合，然后发挥其E3连接酶的作用，降解Axin，从而引起β-catenin降解复合体的解散，胞质内β-catenin聚集，促进Wnt信号通路。之前的研究已经证明Axin与肺癌的侵袭和增殖能力密切相关，因此我们推测，RNF146可能通过调节Axin的稳定性而影响肺癌中β-catenin的表达与定位，从而对肺癌细胞的增殖、侵袭和转移产生影响。　　为了证实我们的推测，我们首先采用RT-PCR、Western-Blot和免疫组织化学方法检测手术切除的肺癌和癌旁肺组织中RNF146的表达水平及其与临床病理因素和肺癌预后的关系、并分析RNF146与Axin和β-catenin表达的相关性。然后在人非小细胞肺癌细胞系中转染RNF146过表达或者干扰质粒，通过上调或干扰RNF146检测肺癌细胞中Axin和β-catenin的变化，以及上调和干扰RNF146后对肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探讨其可能的分子机制。　　方法：　　1、组织来源　　133例NSCLC肺癌组织和40例癌旁肺组织石蜡标本来自2005年1月至2008年12月在中国医科大学附属第四医院行外科手术切除的标本。其中鳞癌62例，腺癌71例，有淋巴结转移60例，无淋巴结转移73例。Ⅰ期69例，Ⅱ-Ⅲ期64例。20例新鲜肺癌组织和癌旁肺组织来自2010-2011年原发性肺癌患者外科手术切除标本。癌旁组织距离癌巢达5cm以上。一部分标本在切除后5分钟内取材并迅速置液氮中速冻，然后置于-80℃深冻冰箱保存备用。另一部分标本离体后用中性福尔马林固定。　　2、支气管上皮、肺鳞癌和肺腺癌细胞系　　正常支气管上皮细胞系HBE，腺癌细胞系A549、H1299购自美国标准菌种收藏所。肺鳞癌细胞系LK2、LH7和腺癌细胞系LTE、SPC购自中国科学院上海细胞库。　　3、免疫组织化学染色　　将石蜡组织切成4μm厚切片，脱蜡，脱水，在PH6柠檬酸盐修复液中高温高压修复3分钟，3％H2O2孵育20分钟。抗RNF146多克隆抗体、抗Axin和抗β-catenin多克隆抗体4℃孵育过夜。采用EnVision试剂盒检测抗体结合。以PBS代替一抗作为阴性对照。DAB显色，苏木素复染细胞核，封片。　　4、质粒构建　　pEX4-hRNF146和对照pEX4质粒，pGPHI-shhRNF146和对照质粒空载体pGPHI shNC均由GenePharma公司构建。si Axin、siβ-catenin和si TCF4购自SantaCruz公司。　　5、细胞培养和细胞转染　　肺癌细胞系用含10％热灭活胎牛血清的RPMI1640或DMEM-F12、100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素的培养基，在37℃、5％CO2条件下培养。每2-3天用0.25％胰酶消化传代。转染前24小时将细胞按50％密度接种于24孔板，采用脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)转染试剂根据说明书将质粒转染至肺癌细胞系A549和LTE中，Western blot检测转染效果。　　6、 RT-PCR　　将组织或转染后的细胞收集，用Trizol Reagent提取转染后细胞的总RNA，具体操作步骤按TaKaRa RNA Kit说明书进行，提取的基因组DNA经紫外分光光度计定量后，进行PCR反应。　　7、Western blot　　将含60μg总蛋白的裂解产物进行SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，5％正常血清封闭，一抗4℃孵育过夜，分别与对应的二抗室温孵育2小时，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。　　8、免疫荧光染色　　固定后的细胞爬片用0.2％ Triton(Ⅹ)-100处理15分钟，PBS冲洗，非免疫动物血清封闭30分钟，滴加一抗，4℃孵育过夜。二抗滴加FITC或TRITC标记山羊抗鼠/兔IgG，37℃孵育1小时， DAPI复染细胞核。同时设立阳性和阴性对照。荧光显微镜观察荧光信号，采集图像。采用IPP软件进行光密度值分析。　　9、MTT检测细胞增殖　　转染12小时后，将各转染组细胞及对照组细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200μl含104个细胞，培养24小时，使用MTT检测试剂盒检测细胞增殖情况，连续检测4天。吸光度由microplate reader检测，波长490nm。单纯加DMSO试剂的孔作为测量值的内参对照，最终值为测量值减去内参对照值。绘制细胞生长曲线。　　10、细胞划痕实验　　用marker笔在6孔板背后，大约每隔0.5-1cm均匀地划横线。每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5×105个细胞，培养24h后用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕。用PBS洗细胞3次，加入无血清培养基，37℃，5％CO2条件下培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。实验至少重复3次，取平均值。　　11、Transwell检测细胞迁移和侵袭　　取100μl细胞悬液（2.5×106个/ml）加入上室中，下室加入600μl含10％胎牛血清RPMI1640培养液。上下室之间用孔径为8μm的聚碳酸酯微孔滤膜分开，37℃、5％CO2孵育箱中培养6小时后吸尽培养基，PBS清洗，甲醇室温固定15分钟，用棉签擦掉上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜，取下聚碳酸酯微孔膜，置载玻片上，镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清RPMI1640培养基以1∶3稀释Matrigel加入上室100μl，在室温下放置3小时。培养24小时后观察结果。　　12、细胞周期实验　　细胞转染24小时后，用0.25％的胰酶消化，吹起后收集，在PBS中离心清洗2次，以70％冷乙醇固定。PBS洗2次去除乙醇，在细胞中加入0.1 mg/ml的RNaseA，37℃，30分钟，然后加入50mg/L的碘化丙啶1ml染色30分钟。用流式细胞仪进行DNA含量和细胞周期分析。　　13、统计学分析　　应用x2和Fisher检验对RNF146、Axin、β-catenin在NSCLC和癌旁肺组织中mRNA及蛋白表达水平及其与临床病理因素间的关系进行统计学处理。Kaplan-Meier显示生存曲线，用Log-rank检验判断差异性。t检验用于其它数据比较，计量资料以三次独立实验的(x)±s表示。使用Mann-Whitney test和Kruskal-Wallistest统计Western Blot、RT-PCR、MTT assay、Matrigelin vasive assay的结果，以mean±SD表示，以P＜0.05表示有统计学意义。　　结果：　　1、RNF146 mRNA和蛋白在NSCLC中过表达　　我们用RT-PCR和Western-Blot方法检测20例配对新鲜NSCLC和癌旁肺组织中RNF146的mRNA及蛋白表达情况，85％(17/20)的病例RNF146 mRNA的表达水平明显高于癌旁肺组织。只有3例显示癌旁组织中RNF146mRNA的水平与癌组织相当或高于癌组织(P=0.030)。80％(16/20)的病例RNF146蛋白表达量明显高于癌旁肺组织(P=0.014)。　　免疫组化检查显示133例NSCLC中RNF146高表达为72例，低表达为61例。RNF146蛋白阳性表达信号主要位于肿瘤细胞的细胞质中。邻近肿瘤的支气管粘膜上皮细胞呈弱或阴性表达。40例癌旁肺组织中仅有8例RNF146呈弱或中等强度表达，并且阳性信号定位于正常支气管粘膜上皮细胞中，在肺泡上皮细胞中呈阴性表达（P＜0.05）。　　2、RNF146蛋白在NSCLC中的表达与临床病理因素及Ⅰ期肺癌患者预后生存期有关　　对133例NSCLC的RNF146表达与临床病理因素相关性进行统计学分析显示RNF146蛋白的表达与肿瘤大小(P=0.044)、组织学分型(P=0.005)、低分化(P=0.002)、淋巴结转移(P=0.009)和pTNM分期(P=0.015)相关。与患者年龄、性别无关(P＞0.05)。Kaplan-Meier分析RNF146与肺癌患者生存时间的关系发现，RNF146的过表达与Ⅰ期肺癌患者预后生存期有关(P=0.016)，RNF146过表达的Ⅰ期肺癌患者生存率明显低于RNF146低表达的患者。与被统计的全部患者或Ⅱ、Ⅲ期NSCLC患者的生存时间无明显相关性。　　3、人正常支气管上皮细胞系HBE及6种非小细胞肺癌细胞系中存在不同程度的RNF146mRNA和蛋白的表达　　RT-PCR和Western-Blot方法检测了人正常支气管上皮细胞系HBE及6种NSCLC细胞系中RNF146 mRNA和蛋白的表达情况。结果显示HBE和LK2（鳞癌）中RNF146 mRNA和蛋白均显示相对低的表达，LTE（腺癌）和LH7（鳞癌）中RNF146蛋白呈中等强度表达，而A549和H1299（均为腺癌）的蛋白水平表达较高。　　4、NSCLC组织中RNF146蛋白表达与Axin表达呈负相关，与β-catenin的核表达呈正相关　　免疫组化方法检测133例NSCLC中Axin和β-catenin的表达情况显示，75/133例(56.4％) NSCLC Axin的胞质表达减弱或缺失。72例RNF146高表达的病例中49例(68.1％) Axin表达减弱或缺失，RNF146低表达的61例中只有26例(42.6％) Axin表达减弱或缺失。RNF146与Axin的表达呈明显的负相关(P=0.003)。　　93/133例(69.9％) NSCLC中β-catenin细胞膜表达减少或消失，出现胞质的表达，其中26例(19.5％)出现细胞核的表达。统计学分析显示，β-catenin细胞膜表达的减弱和细胞质表达的增多与RNF146的表达无相关性(P=0.524)。但在72例RNF146高表达标本中19例(26.4％)出现β-catenin细胞核阳性表达，61例RNF146低表达标本中只有7例(11.5％)出现核阳性。RNF146的高表达与β-catenin的细胞核表达呈正相关(P=-0.047)。　　5、NSCLC中过表达或干扰RNF146影响Axin的表达和β-catenin核定位　　分别在LTE细胞系中瞬时转染pEX4-hRNF146质粒和对照pEX4空质粒，上调RNF146的表达;在A549细胞系中瞬时转染RNF146 shRNA和对照shNC，干扰RNF146的表达。转染48小时后，Western-Blot检测RNF146的转染效率以及Axin和β-catenin的变化。结果显示，LTE肺癌细胞中RNF146的上调能够抑制Axin蛋白的表达，并增加β-catenin的蛋白水平。反之，A549细胞中干扰RNF146能增加Axin蛋白水平，减少β-catenin蛋白水平。RT-PCR检测Axin和β-catenin的mRNA水平时没有发现这种改变。　　免疫荧光染色检测转染后Axin和β-catenin在细胞内的表达及定位。结果进一步显示过表达RNF146的LTE细胞中，Axin胞质表达减少，β-catenin胞质和胞核中的表达均增多。相反，干扰RNF146的A549细胞中，Axin胞质表达明显增多，β-catenin胞质和胞核中的表达均减少。　　6、RNF146调节cyclinD1和cyclinE水平，调控细胞周期并促进肺癌细胞增殖　　LTE和A549细胞系分别转染pEX4-RNF146和RNF146-shRNA以及各对照质粒，MTT观察各组肺癌细胞增殖情况。LTE细胞系转染pEX4-RNF146组细胞增殖明显，而空质粒组和对照组细胞增殖相对较慢。shRNF146干扰A549细胞系后，肺癌细胞的增殖明显较对照组慢。流式细胞仪检测各组细胞周期变化情况显示，LTE细胞系中与对照组和空质粒组相比，转染组的G0/G1期比例明显减少，S期比例增加。干扰RNF146的A549细胞系G0/G1期比例增加，S期比例减少。　　我们用Western-Blot检测了与细胞周期相关的调控蛋白的表达情况。上调RNF146可以使肺癌细胞cyclin D1，cyclin E and CDK4表达明显增多，而对cyclinA、cyclinB、pRB、P21、P27和P53无明显影响。干扰RNF146后，cyclinD1，cyclinE和CDK4表达减少。　　7、RNF146促进肺癌细胞迁移和侵袭，调节MMP2和MMP7的变化　　过表达和干扰RNF146后，我们采用Wound-healing实验和Transwell实验检测了LTE和A549肺癌细胞迁移和侵袭能力的变化。Wound-healing结果显示24小时LTE转染组划痕明显缩小且有融合趋势。A549干扰组细胞迁移较对照组和空质粒组缓慢。Transwell实验检测肺癌细胞的迁移侵袭率:LTE转染组迁移和侵袭实验都可见到Transwell小室下表面的LTE细胞穿出率较对照组和空质粒组增多。A549细胞系转染shRNF146，与未处理对照组和空质粒组比较，Transwell小室下表面的A549细胞穿出率减少。　　Western-Blot方法检测了过表达或干扰RNF146后MMP2、MMP7、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表达变化。结果过表达RNF146后LTE细胞内MMP2和MMP7表达明显增加，而RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表达变化不明显。而干扰RNF146后A549中MMP2和MMP7表达明显减少。　　8、肺癌RNF146通过Wnt/β-catenin途径调节靶蛋白cyclinD1和MMP7的水平　　在A549细胞系中干扰RNF146和Axin，结果发现与对照组比较，在干扰了Axin的细胞中RNF146的下调并不能使β-catenin、cyclinD1、cyclinE和MMP7的水平明显减少。在过表达RNF146的LTE细胞中，敲除β-catenin，与对照组比较，尽管Axin水平明显减少，但也不能明显增加cyclinD1、cyclinE和MMP7的水平。而对MMP2的影响依然存在。这进一步证明RNF146是通过影响Axin和β-catenin，从而调节肺癌细胞增殖和侵袭相关蛋白。　　9、肺癌细胞中RNF146对cyclinD1和MMP7的调控依赖TCF-4　　我们在分别过表达或干扰RNF146的LTE和A549细胞中干扰TCF-4的表达水平，然后观察cyclinD1和MMP7的蛋白表达水平的变化。结果发现干扰了内源性TCF-4的细胞系，RNF146的上调并不能使cyclinD1和MMP7的表达增多。而在RNF146和TCF-4同时敲除的A549中，cyclinD1和MMP7的表达明显减少。这些说明了RNF146对cyclinD1和MMP7的调控作用是依赖于TCF-4而存在的。　　结论：　　1、RNF146 mRNA和蛋白在NSCLC和细胞系中过表达，并与肺癌大小、不良分化、淋巴结转移和p-TNM分期等临床病理因素相关;RNF146的过表达与Ⅰ期非小细胞肺癌患者预后生存期有关。　　2、NSCLC组织中RNF146蛋白表达与Axin表达呈负相关，与β-catenin的核表达呈正相关。肺癌细胞系中过表达RNF146能下调Axin的表达，诱导β-catenin表达和核内分布。　　3、RNF146能够促进肺癌细胞增殖，并通过调节细胞周期相关蛋白cyclinD1、cyclinE和CDK4调控细胞周期变化。　　4、RNF146促进肺癌细胞迁移和侵袭，调节MMP2和MMP7的水平。　　5、RNF146调节肺癌细胞的增殖和侵袭依赖于经典的Wnt/β-catenin途径。