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前言:WNK激酶(with no lysine kinase)属于丝/苏氨酸激酶家族,因该家族的激酶结构域缺乏与ATP结合的赖氨酸残基而得名,目前发现WNKl~WNK4共4个家族成员。其中WNK1的大片段缺失和WNK4的错义突变会导致一种罕见的常染色体显性遗传病—II型假性低醛固酮血症(PHAII)的发生,该病是肾脏离子转运异常所致。实验研究证实,WNK4特异性表达在远端肾单位,它能够抑制远端肾单位的NCCT、ENa C、ROMK等离子通道蛋白的活性和表达。2012年通过外显子组测序方法,克隆了PHAII的另外两个致病基因,KLHL3和CUL3。他们是E3连接酶泛素降解复合物组分,KLHL3特异性结合并降解WNK4。研究表明,WNK4的致病性突变位于WNK4的酸性基序上,KLHL3主要是结合域的磷酸化位点S433的错义突变,上述突变直接抑制了KLHL3和WNK4的结合进而抑制了WNK4的降解,从而导致临床症状的产生。糖皮质激素(glucocorticoid,Gc)是由肾上腺皮质分泌的甾体激素,糖皮质激素的生理和药理作用有调节免疫、代谢、渗透压、生长发育等。Gc通常通过经典的基因组机制发挥作用,即脂溶性的Gc可以与存在于细胞浆内的糖皮质激素受体结合,随后与靶基因启动子附近的糖皮质激素反应元件(glucocorticoid responsive element,GRE)结合,进而调节基因的转录,抑制或增强基因的表达。近年来的研究发现,Gc还存在不依赖基因组途径的其它作用,称之为“非基因组作用”,可发生在红细胞、血小板上,也可以发生在真核细胞上。对于Gc的非基因组效应的分子机制,目前还不十分清楚,但研究表明,PI3K、蛋白激酶AKT、p38、PKC、离子通道、第二信使c AMP、IP3等与糖皮质激素信号转导有关。Gc有醛固酮样作用,可作用于远端肾单位,促进水钠贮留。我们课题组前期工作鉴定了WNK4基因启动子区域的糖皮质激素反应元件,Gc可通过该GRE下调WNK4基因表达。然而,糖皮质激素是否还通过泛素化降解路径改变WNK4的功能尚不清楚。由于无商品化用于免疫沉淀的WNK4抗体,本研究转染HA-WNK4表达载体至HEK293细胞,糖皮质激素刺激后,HA抗体免疫沉淀,泛素抗体检测WNK4泛素化状态变化,随后糖皮质激素刺激HEK293细胞和M1细胞,定量PCR及Western blot检测WNK4、KLHL3和CUL3基因及蛋白表达,Western blot检测蛋白酶体抑制剂及糖皮质激素受体特异性抑制剂作用下WNK4蛋白表达量,免疫共沉淀检测PKC激酶抑制剂作用下KLHL3和WNK4的结合,以揭示糖皮质激素对WNK4泛素化降解的作用及其机制。材料与方法:1、实验材料:HEK293细胞系、M1细胞系。2、实验方法:HEK293、M1细胞培养、基因瞬时转染、Real-time PCR检测mRNA表达、Western blot检测蛋白表达、免疫共沉淀检测WNK4泛素化状态及WNK4与KLHL3结合力、统计学分析。结果:1、HA-WNK4表达载体转染HEK293细胞后,IP结果显示糖皮质激素刺激后泛素抗体杂交信号减弱(P<0.05)。2、Real-time PCR和Western blot结果显示,糖皮质激素明显下调WNK4基因mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),明显下调KLHL3基因mRNA及蛋白表达水平(P<0.05),而CUL3基因mRNA及蛋白表达水平均无显著变化。3、加入蛋白酶体抑制剂MG-132及糖皮质激素受体拮抗剂RU486后,WNK4蛋白量增加(P<0.05)。4、免疫共沉淀结果显示,加入PKC抑制剂后,WNK4杂交信号增强(P<0.05)。结论:1、糖皮质激素能够改变WNK4泛素化状态。2、糖皮质激素通过基因组机制下调KLHL3表达,并通过PKC代表的激酶路径改变KLHL3与WNK4的结合,抑制WNK4降解。