目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是一种常见的流行于婴幼儿的呼吸道病毒,是属于副黏病毒科的负链RNA病毒。RSV是秋冬季节引起婴幼儿、老年人和免疫功能低下人群罹患严重呼吸道疾病的主要病原体。流行病学调查发现,24个月以内的婴幼儿几乎全部有过RSV感染史,同时RSV感染可以诱导婴幼儿及成人的喘息发作。病毒感染及其介导的炎症应答会影响气道功能,引起哮喘样症状,例如气道的敏感性增加、气道粘液分泌增多及嗜酸性粒细胞浸润增多等。作为重要的适应性免疫细胞,T淋巴细胞在RSV感染引起的气道炎症中发挥重要作用,其中Th1和Th2细胞之间的失衡是影响疾病进展及严重程度的关键因素。RSV感染期间,Th1细胞被认为起到保护性作用,其分泌的Th1型细胞因子如IFN-γ可以通过减少趋化因子CCL11、CCL17和CCL22的产生,进而影响嗜酸性粒细胞在肺部的聚集。与此相反,Th2型细胞却可以通过分泌Th2型细胞因子（如IL-4、IL-5、IL-13等）募集活化嗜酸嗜碱细胞以及促进粘液分泌、增加免疫球蛋白Ig E的产生、加重气道炎症和气道高反应性。因此,阐明Th2细胞活化相关机制并加以调控,对临床RSV感染的治疗具有积极意义。2型固有淋巴细胞（ILC2s）是一类淋巴样细胞,但其不同于T、B细胞,近些年ILC2s最初在肠脂肪等组织中被发现,后来的研究表明其也在其他组织器官中存在,例如肝、脾、肺及皮肤。ILC2s的特征是不表达Lineage（如CD3、CD4、CD5、CD8、CD11b、Gr-1、CD19、B220、NK1.1、TCRδ等）标识分子,但表达c-Kit、Sca-1、Thy1.2及ST2,其能在IL-25、IL-33或胸腺基质淋巴生成素（TSLP）的刺激下增殖活化,通过分泌Th2型细胞因子（如IL-5、IL-9、IL-13等）发挥免疫学效应。在呼吸道病毒感染早期,ILC2s可通过分泌2型细胞因子介导炎症反应。且研究显示,ILC2s的活化早于Th细胞。我们前期研究发现,ILC2s可以通过膜分子OX40/OX40L调控RSV感染鼠肺组织内CD4+T细胞的增殖与活化,而隔断二者密切接触或予以单克隆抗体阻断OX40L则明显下调CD4+T细胞的活化情况,提示膜分子在介导CD4+T细胞活化中的重要性。然而,除OX40/OX40L轴外,ILC2s是否还可通过其他途径影响T细胞生物学活性,目前尚不清楚。众所周知,来自抗原提呈细胞的主要组织相容性复合体II（MHCⅡ）和B7分子是初始CD4+T细胞活化所必需的膜蛋白。一般情况下,作为专职抗原提呈细胞的树突状细胞（DCs）在活化初始CD4+T细胞方面发挥着关键性的作用。然而最近有研究表明,在肠道蠕虫感染中,肠组织内ILC2s亦可作为非专职抗原提呈细胞,通过其表面表达的MHCⅡ分子调控肠粘膜组织内CD4+T细胞的分化和增殖。然而,在RSV介导的急性呼吸道感染过程中,ILC2s是否亦可作为抗原提呈细胞或是通过MHCⅡ分子影响T细胞的增殖及分化尚不清楚。因此,本研究利用RSV经鼻急性呼吸道感染小鼠模型,结合临床RSV感染患儿标本,探讨ILC2s对CD4+T细胞分化及Th1/Th2平衡的影响及其调控机制。我们发现CD4+T细胞是介导RSV急性气道炎症的重要效应细胞,ILC2s则是调控CD4+T细胞活化与分化的关键因素。ILC2s通过其表面的MHCⅡ分子,活化CD4+T细胞,并诱导其向Th2分化。研究方法:1、临床病例的纳入。2021年10月到2021年12月因呼吸道感染收入中国医科大学附属第一医院儿科病房的患儿,使用呼吸道合胞病毒/腺病毒联检试剂盒（免疫层析法,V740001AC）对其鼻试纸进行检测,结果显示为阳性的患儿为RSV阳性实验组,RSV阴性患儿为呼吸道感染对照组。与上述患儿同一时期入院、年龄在2-6岁的拟行眼部斜视手术的儿童做为健康对照组。所有患儿监护人均有知情告知。排除标准:过去1个月内使用过全身激素或抗病毒药物的患儿及患自身免疫性疾病患儿。2、临床患儿资料的收集及样本处理。对入组患儿采用统一的信息表收集资料,包括:一般资料、现病史、既往史、出生及喂养情况、临床症状、体征、辅助检查及治疗情况等。使用肝素钠抗凝采血管采集研究对象静脉全血1ml,并制备外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,流式细胞术分析外周血中CD4+T细胞、T-bet+CD4+T细胞及GATA3+CD4+T细胞的表达情况。3、建立动物模型。SPF级BALB/c鼠（6-8周,雌性）购于本溪长生生物有限公司。小鼠左侧鼻孔滴入含2×10~6 TCID50（组织细胞半数感染量）RSV病毒悬液20μl,收集感染后第3天和第6天的标本。在CD4+T细胞阻断实验中,阻断组小鼠于RSV感染前24小时给予抗CD4单克隆抗体250μg（腹腔注射）。在回输实验模型中,免疫磁珠分选感染RSV第3天的BALB/c鼠肺组织中的ILC2s,并将ILC2s（2×10~5个细胞）于感染前两小时回输至正常BALB/c鼠体内（经尾静脉）。4、小鼠肺炎症的检测。取模型鼠左肺下叶组织固定并进行HE染色,观察肺组织的形态及炎症浸润情况。收集肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluids,BALF）,上清用于检测细胞因子水平。细胞沉淀涂片后用瑞氏吉姆萨染色,在显微镜下计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞数量及百分比。5、流式细胞术检测小鼠肺组织CD4+T细胞及ILC2s。利用流式细胞术分析RSV感染后0,3,6天以及回输ILC2s后模型鼠肺组织中CD4+T细胞及分泌IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13的CD4+T细胞的数量以及肺组织中ILC2s及其MHCⅡ分子及B7分子表达水平。6、ELISA法检测肺组织及BALF中Th1、Th2型细胞因子水平。应用ELISA商品试剂盒,按照说明书方法检测模型鼠肺组织及肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-13细胞因子水平。7、Real-time PCR法检测模型鼠肺组织及共培养中CD4+T细胞中Th1、Th2型细胞因子、鼠肺ILC2s的MHCⅡ分子及B7分子的m RNA表达水平。分别提取模型鼠肺总RNA、分选模型鼠肺ILC2s后提取细胞总RNA以及分选共培养混合物中CD4+T细胞后提取RNA,逆转录成c DNA,利用Real-time PCR术分析RSV感染后0,3,6天肺组织和共培养中CD4+T细胞的IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13以及ILC2s中CD80、CD86、MHCⅡ分子的m RNA表达情况。8、Western Blot技术检测肺组织中ILC2s的MHCⅡ、CD80、CD86的表达水平。免疫磁珠分选RSV感染后0,3,6天模型鼠肺组织中ILC2s,提取ILC2s蛋白后利用Western Blot技术检测其MHCⅡ、CD80、CD86的蛋白表达水平。结果:1、RSV感染导致患儿外周血中CD4+T细胞的增殖与Th2极化:流式细胞术检测入组患儿外周血单个核细胞发现,呼吸道感染患儿CD4+T细胞的百分比较正常患儿显著升高,且RSV（+）呼吸道感染患儿以Th2升高为特征,导致患儿外周血中Th1/Th2的失衡,平衡偏向Th2。2、RSV感染患儿的症状及体征:与RSV阴性的呼吸道感染患儿相比,RSV阳性患儿并无特征性的症状及体征。两组患儿均有咳嗽、发热及喘息等症状,部分患儿有肺啰音及肺影像学改变。血细胞分析结果显示RSV感染患儿以淋巴细胞升高为主。3、RSV感染诱导模型鼠肺组织内CD4+T细胞向Th2型细胞活化:RSV感染增加模型鼠肺组织中CD4+T细胞及IFN-γ+CD4+T、IL-4+CD4+T、IL-5+CD4+T、IL-13+CD4+T的数量,且以Th2CD4+T细胞增加为主,平衡偏向Th2。4、CD4+T细胞是介导RSV气道炎症的关键效应细胞:体内阻断CD4+T细胞后再感染RSV,结果发现模型鼠肺组织内炎性细胞的浸润减轻,Th2型细胞因子的m RNA表达下降,BALF中炎性细胞数量减少,其上清中Th2型细胞因子浓度降低,证实CD4+T细胞是介导RSV急性肺炎症的重要效应细胞。5、ILC2s促进RSV感染后肺组织内CD4+T细胞的扩增及加重Th1/Th2失衡:与未回输ILC2s组相比,RSV感染前回输ILC2s的模型鼠肺组织内CD4+T细胞增殖及活化程度显著升高,与此同时,分泌Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的CD4+T细胞亚群的数量及百分比亦明显增加,由此导致肺组织内Th1/Th2比率下降,提示ILC2s在RSV感染诱导肺CD4+T细胞的增殖活化及促Th1/Th2失衡方面发挥重要作用。6、ILC2s加重RSV感染后气道炎症:回输ILC2s后再感染RSV的BALB/c鼠肺局部炎症加重,气道炎细胞浸润增加且管壁变形,BALF中炎性细胞的数量增加,且其上清中Th2型细胞因子浓度升高。同时,肺组织内Th2型细胞因子的m RNA表达水平亦明显升高。提示ILC2s是加重RSV气道炎症的重要因素。7、RSV感染促进肺ILC2s的增殖及其MHCⅡ分子及B7分子表达:感染RSV的模型鼠肺组织中ILC2s数量明显增多,且表达MHCⅡ分子、CD80及CD86的ILC2s数量及其表达水平均明显增加。8、MHCⅡ分子是ILC2s调控CD4+T细胞增殖及加剧Th1/Th2的失衡的重要膜分子:分选感染RSV第3天的BALB/c鼠肺ILC2s和来自正常小鼠脾的CD4+T细胞,体外共培养的同时加入抗MHCⅡ单克隆抗体。结果显示阻断MHCⅡ分子显著降低CD4+T细胞数量及Th2型CD4+T细胞,进而导致CD4+T细胞的Th1/Th2比值上升显著,提示ILC2s通过MHCⅡ分子介导CD4+T细胞的增殖及加剧Th1/Th2失衡。结论:1、RSV感染可诱导患儿外周血及BALB/c鼠肺组织内CD4+T细胞向Th2分化,且CD4+T细胞是介导RSV气道炎症的重要效应细胞。2、ILC2s促进CD4+T细胞的增殖活化的同时加重气道炎症。RSV感染导致鼠肺ILC2s表面MHCⅡ及B7分子（CD80和CD86）的表达明显升高。3、MHCⅡ是ILC2s诱导CD4+T细胞增殖活化及向Th2极化的重要膜分子。