研究背景和目的创面愈合是烧伤救治的关键问题,为了缩短创面的自然愈合时间,改善创面的愈合质量,除现有的药物治疗和外科手术等修复创面方法外,寻找更好的治疗药物或其他手段以达到创面的高质量愈合,一直都是临床医师特别是烧伤科医师的追求目标和科研攻关方向。以往研究表明,雌激素可对创面愈合的很多关键细胞起作用,其中就包括雌激素可以促进角质形成细胞增殖,但目前关于雌激素影响角质形成细胞增殖的下游分子机制尚不完全清楚,有必要进一步研究雌激素促进角质形成细胞增殖的具体信号转导通路,从而在细胞分子层面阐明雌激素加快创面愈合的机制,为临床应用雌激素治疗创面提供了更进一步的理论基础,同时也为未来更深入的研究雌激素提供了新的研究思路和方向。为此,本研究主要目的是通过观察雌激素缺乏时对小鼠表皮发育和创面愈合的影响和雌激素对人永生化角质形成细胞系(Ha Ca T)增殖的影响,从而探索雌激素促进角质形成细胞增殖的分子机制。研究方法(1)将通过阴道脱落细胞学检查法选取的5只处于动情期的C57BL/6成年(8周龄大小)小鼠设为动情期组,将5只性发育前(4周龄大小)行卵巢切除的成年(8周龄大小)C57BL/6小鼠设为卵巢切除组。取2组小鼠尾根部1 cm宽的全层皮肤,免疫组织化学法观察表皮增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞分布并计数,HE染色观察并测量表皮厚度。(2)将通过阴道脱落细胞学检查法选取的5只处于动情期的C57BL/6成年(8周龄大小)小鼠设为动情期组,将5只性发育前(4周龄大小)行卵巢切除的C57BL/6成年(8周龄大小)小鼠设为卵巢切除组。在2组小鼠背部脊柱两侧制作长度为1 cm的全层皮肤切口,并在伤后的0、1、3、5、7天拍照观测创面愈合率,然后在伤后第7天取小鼠创周皮肤组织,通过HE染色观测2组小鼠创面新生上皮长度。(3)通过阴道脱落细胞学检查法将16只C57BL/6成年(8周龄大小)小鼠分为动情前期组、动情期组、动情后期组、动情间期组,每组4只。将4只性发育前(4周龄大小)行卵巢切除的成年(8周龄大小)C57BL/6小鼠设为卵巢切除组。采集5*本课题受创伤烧伤复合伤国家重点实验室项目(No.SKLZZ201230);国家自然科学基金项目(No.81201464);国家卫生部卫生行业专项计划(No.201202002);和中国人民解放军科学研究基金项目(No.BWS11J0390)资助。组小鼠腹部正常皮肤组织,用蛋白质免疫印迹法检测p-erk、p-akt、pcna蛋白表达水平。(4)取处于对数生长期hacat细胞,用含体积分数10%fbs的rpmi1640培养液培养(下同),按随机数字表法分为阴性对照组、单纯雌二醇组、蛋白激酶b(akt)抑制剂组、细胞外信号调节激酶(erk)抑制剂组,每组含25个孔。各组培养液中,阴性对照组加入1μl二甲基亚砜;单纯雌二醇组加入100nmol/l17β-雌二醇1μl;akt抑制剂组和erk抑制剂组均加入同前剂量与体积17β-雌二醇,另分别加入10μmol/lly294002和30μmol/lpd98059各1μl。分别于培养0(即刻)、24、48、72、96h,每组取5孔细胞,用细胞计数试剂盒与酶标仪检测细胞增殖水平(结果以吸光度值表示)。(5)另取处于对数生长期hacat细胞,同前(4)实验分组和处理细胞,每组含3个孔。培养72h,用流式细胞术检测细胞周期分布,并以此按公式计算出各组细胞的增殖指数(pi,proliferationindex)和s期比例(spf,sphasefraction)。(6)另取处于对数生长期hacat细胞,按雌激素(17β-雌二醇)处理时间不同分为7个组,即0min组(未经雌激素处理)、5min组、15min组、30min组、60min组、120min组、240min组。在相应培养时间收集各组细胞并提取蛋白,然后用蛋白质免疫印迹法检测各组细胞磷酸化erk(p-erk)、磷酸化akt(p-akt)和增殖细胞核抗原(pcna)蛋白水平。(7)另取处于对数生长期hacat细胞,同前(4)实验分组和处理细胞,每组含3个孔。培养72h,收集各组细胞并提取蛋白,然后用蛋白质免疫印迹法检测各组细胞磷酸化erk(p-erk)、磷酸化akt(p-akt)和增殖细胞核抗原(pcna)蛋白水平。(8)另取处于对数生长期hacat细胞,同前(4)实验分组和处理细胞,每组含3个孔。培养72h,收集各组细胞并提取总rna,然后用实时荧光定量pcr法检测各组细胞糖原合成激酶3β(glycogensynthasekinase3β,gsk-3β)基因和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mtor)基因的表达水平。(9)统计分析:对数据行t检验、单因素方差分析、析因设计方差分析、lsd检验。研究结果(1)2组小鼠表皮pcna阳性细胞主要集中于表皮基底层;卵巢切除组小鼠表皮中pcna阳性细胞数为(37?12)个,明显少于动情期组的(96?15)个(t=15.3,p<0.01)。卵巢切除组小鼠表皮厚度为(33.5?3.0)μm,明显低于动情期组的(51.4?3.1)μm(t=20.7,p<0.01)。(2)在伤后第5天,与动情期组小鼠创面愈合率(59.0?2.2)%相比,卵巢切除组小鼠创面愈合率(49.9?2.1)%降低(p<0.05),在伤后第7天,与动情期组小鼠创面愈合率(85.5?3.0)%相比,卵巢切除组小鼠创面愈合率为(73.0?0.9)%,愈合显著延迟(p<0.01)。(3)不同动情周期的小鼠和卵巢切除小鼠正常皮肤中,p-akt、p-erk以及pcna表达水平不一致。动情前期和动情期小鼠皮肤中p-erk、p-akt、pcna蛋白的表达水平要高于动情后期、动情间期和卵巢切除组小鼠。(4)培养0~48h,单纯雌二醇组与阴性对照组细胞增殖水平差异不明显(p值均大于0.05)。培养72h,与阴性对照组的0.983?0.060比较,单纯雌二醇组细胞增殖水平明显增高(2.092?0.177,p<0.01);akt抑制剂组、erk抑制剂组细胞增殖水平分别为0.325?0.031、0.359?0.063,均明显低于前2组(p值均小于0.01)。培养96h,单纯雌二醇组细胞增殖水平为1.888?0.022,仍高于阴性对照组的0.669?0.032(p<0.01),而akt抑制剂组和erk抑制剂组增殖水平分别为0.367?0.019、0.474?0.011,均低于阴性对照组和单纯雌二醇组(p值均小于0.01)。(5)培养72h,与阴性对照组的pi(51.6?1.1)%比较,单纯雌二醇组细胞pi明显升高[(58.5?0.8)%,p<0.05];akt抑制剂组、erk抑制剂组细胞pi分别为(34.9?0.8)%、(48.2?0.4)%,均明显低于前2组(p值小于0.01或0.05)。与阴性对照组的spf(31.7?1.2)%比较,单纯雌二醇组细胞spf明显升高[(40.2?0.5)%,p<0.01];akt抑制剂组spf为(15.7?0.7)%,明显低于前两组(p值均小于0.01),erk抑制剂组spf为(33.0?0.1)%,与阴性对照组差异不明显(p>0.05),但仍低于单纯雌二醇组(p<0.01)。(6)培养5min后,p-erk即开始显著的升高,5、15、30min组细胞p-erk表达水平分别为3.306?0.042、1.847?0.053、0.545?0.053,与0min组细胞p-erk表达水平0.037?0.017)相比,均有显著性升高(p值均小于0.01),但随后又逐渐下降,即0min组细胞与60min、120min、240min组细胞差异不明显(p值均大于0.05)。培养15min后,与0min组细胞p-akt表达水平0.100?0.007相比,15、30、60、120min组细胞p-akt表达水平分别是0.153?0.007、0.188?0.009、0.201?0.007、0.220?0.006,均有显著性升高(p<0.05或p<0.01),但240min组细胞p-akt表达水平与0min组细胞相比差异不明显(p>0.05)。与0min组细胞相比,在17β-雌二醇处理hacat细胞240min内,pcna表达水平一直无明显变化(p>0.05)。(7)培养72 h,与阴性对照组的0.566?0.034比较,单纯雌二醇组细胞p-Akt蛋白水平明显升高(1.048?0.077,P<0.01);Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞p-Akt蛋白水平分别为0.682?0.095、0.672?0.019,显著低于单纯雌二醇组(P值均小于0.01)。培养72 h,与阴性对照组的0.469?0.013比较,单纯雌二醇组、Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平均明显升高(分别为1.064?0.089、1.010?0.038、0.778?0.065,P值均小于0.01)。与单纯雌二醇组比较,ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平明显降低(P<0.01)。培养72 h,与阴性对照组的0.386?0.053比较,单纯雌二醇组细胞PCNA蛋白水平明显升高(0.743?0.043,P<0.01);Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞PCNA蛋白水平分别为0.264?0.019、0.223?0.065,明显低于前2组(P值均小于0.01)。(8)培养72 h,与阴性对照组细胞m TOR基因表达水平(1.003?0.058)相比,单纯雌二醇组细胞mTOR基因表达水平明显升高(1.803?0.292,P<0.05),而Akt抑制剂组细胞(1.255?0.081)和ERK抑制剂组细胞(0.987?0.042)mTOR基因表达水平升高不明显(P>0.05)。与单纯雌二醇组相比,Akt抑制剂组与之差异不明显(P>0.05),ERK抑制剂组mTOR基因表达水平明显降低(P<0.05)。与阴性对照组细胞Gsk-3β基因表达水平(1.015?0.124)相比,单纯雌二醇组细胞Gsk-3β基因表达水平明显降低(0.043?0.003,P<0.01),而Akt抑制剂组细胞(0.526?0.0042)和ERK抑制剂组细胞(0.276?0.040)Gsk-3β基因表达水平也明显降低(P值均小于0.01)。与单纯雌二醇组相比,ERK抑制剂组与之差异不明显(P>0.05),Akt抑制剂组Gsk-3β基因表达水平明显升高(P<0.01)。研究结论雌激素缺乏时,小鼠表皮增殖发育能力减弱,创面愈合速率减慢。雌激素可通过ERK/Akt信号通路介导下游PCNA的表达从而调控角质形成细胞的增殖,从增殖角度为雌激素促进皮肤创面再上皮化、加快创面愈合提供了分子机制。