Microbulbifer sp. ALW1和Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶的研究

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本论文以从腐烂海带样品中分离得到的一株褐藻胶降解菌ALW1为研究对象,从分子和生理生化水平对其进行分类鉴定;利用硫酸铵沉淀、阴离子层析及凝胶过滤层析分离纯化获得电泳纯胞外褐藻胶裂解酶,并研究了菌株ALW1褐藻胶裂解酶的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性。此外,进行了Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶的克隆、表达、纯化、重组酶的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性研究,主要结论如下:(1)16S rRNA基因序列分析显示菌株ALW1归属于Microbulbifer sp.,命名为Microbulbifer sp.ALW1。结合菌株的表型及生理生化鉴定,菌株ALW1可能是Microbulbifer sp.的一个潜在新种。(2)分离纯化获得电泳纯Microbulbifer sp.ALW1褐藻胶裂解酶。底物特异性研究结果显示,该褐藻胶裂解酶同时具有降解聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的活性。酶的最适反应温度和pH值分别为45°C和7.0,该酶在温度低于40°C,pH值为5.0-9.0时稳定。Na+可明显增强褐藻胶裂解酶的活力,Ba2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+和Al3+对酶具有不同程度的抑制作用。除下EDTA,该褐藻胶裂解酶对检测的其他抑制剂和去垢剂具有较好的抗性。(3)Microbulbifer sp.ALW1褐藻胶裂解酶酶解产物具有良好的抗氧化活性,对ABTS和·OH自由基的半数抑制剂量IC50分别为1.23 mg/mL和3.35 mg/mL,还具有还原能力。(4)Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶的基因大小为1137 bp,预测编码含378个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶具有高的相似性,预测本研究克隆的基因编码褐藻胶裂解酶。该重组酶的理论分子量大小为42.5 kDa,理论等电点为8.15。采用同源建模法建立Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶的三维结构,富含螺旋结构。(5)将Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶基因进行异源表达和重组酶纯化。底物特异性研究表明,该重组酶专一性降解聚甘露糖醛酸。该重组酶的最适反应温度和pH分别为30°C和7.0,在温度低于50°C,pH值为3.0-11.0时稳定。K+、Na+、Li+和Ca2+对重组酶活性没有影响,Ba2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+对重组酶具有不同程度的抑制作用。除下SDS和DTT,重组酶对检测的其他抑制剂和去垢剂具有较好的抗性。(6)Pseudomonas syringae重组酶的酶解产物具有良好的抗氧化活性,对ABTS和·OH自由基的半数抑制剂量IC50分别为1.56 mg/mL和0.56 mg/mL,还具有还原能力。本论文研究结果表明,Microbulbifer sp.ALW1是一株新型产胞外褐藻胶裂解酶菌株,为该菌株褐藻胶裂解酶的深入研究及活性褐藻胶寡糖的开发奠定了基础。Pseudomonas syringae褐藻胶裂解酶的克隆、表达和酶学性质研究为进一步研究该酶的结构、功能及酶的定向进化奠定了良好的基础。
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