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鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)属于支原体目、支原体科、支原体属,是禽类重要病原体之一。鸡毒支原体可感染鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、家雀等多种禽类,主要表现为呼吸道症状。鸡群感染鸡毒支原体后除表现咳嗽、流鼻涕、流泪、啰音、呼吸困难等症状外,还可导致蛋鸡产蛋率下降,种蛋孵化率降低,肉鸡生长发育受阻,饲料转化率降低。该病发病率极高,几乎100%的鸡场都有此病,鸡场一旦感染就很难彻底清除,给养禽业带来巨大的损失。很多病原菌为了适应体内外的环境会形成生物被膜。大量的研究表明,生物被膜的形成与病原菌的免疫逃避和抗药性有关,是影响感染的重要因素。本研究成功构建了鸡毒支原体随机插入转座载体,利用该载体进行了随机突变,建立了随机突变库。并利用该随机突变库成功筛选了12株生物被膜形成突变菌株,并成功定位了10个与之对应的突变基因。支原体存在有一种重要的结构脂质相关膜蛋白(lipid associated membrane proteins,LAMPs),在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用。近些年,越来越多的报道指出脂蛋白在支原体毒力及致病性中占有重要作用。为探讨LAMPs在鸡毒支原体致病性中的作用,我们也进行了以下研究。1.鸡毒支原体随机转座突变库的构建及生物被膜相关基因的筛选为研究鸡毒支原体中重要蛋白与生物被膜形成的关系。本研究拟构建mini-Tn4001SpGm随机转座插入载体。该转座子具备以下特征：含庆大霉素抗性基因,由螺原体螺旋启动子启动抗性基因的表达;抗性基因两侧为含Inner和Outer的IS256插入重复区；重复区之外为金黄色葡萄球菌转座酶基因。通过对随机缺失株的抗性筛选和基因组PCR方法检测,成功获得了738株随机缺失柱。利用结晶紫染色定量法所构建的738株突变库中的突变株进行生物被膜能力形成检测,共通过3轮筛选出12株生物被膜减少的突变株,其减少率在30-80%之间,又通过gene walking鉴定10个被插入阻断的基因分别为S-adenosylmethionine synthetase、Phosphomannomutase、ABC transporter ATP-binding protein、ABC transporter permease、variable lipoprotein family protein、methionyl-tRNA synthetase、PTS system fructose-specific enzyme EIIABC、 Pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha、enolase和conserved hypothetical membrane protein。这10个基因按功能分括Gene regulation、Cellular processes、Translationfunction、Metabolism和Unknown function。我们鉴定出了多个影响生物膜形成的新基因,这些基因的发现为进一步研究鸡毒支原体生物膜形成的调控机制,研究鸡毒支原体的慢性感染机制奠定了基础。2.鸡毒支原体LAMPs诱导DF1细胞凋亡研究鸡毒支原体存在有一种重要的结构脂质相关膜蛋白(LAMPs),在支原体与宿主之间的相互作用中起重要作用。越来越多的报道指出脂蛋白在支原体毒力及致病性中占有重要作用。首先建立了鸡毒支原体LAMPs与鸡胚成纤维细胞DF1相互作用的模型,采用MTT法检测LAMPs对细胞生长的抑制率,通过DAPI,TUNEL, AO-EB和Annexin-V-PI检测确定了LAMPs具有诱导DFl细胞凋亡的作用。为了进一步确定LAMPs诱导凋亡的调控机制和途径信号通路,实验证实,LAMPs可以激活DF1细胞中caspase 3的活性,裂解PARP。对其凋亡信号通路的了解,将有助于人们找到合适的药物作用靶标,对鸡毒支原体感染的疾病进行治疗。