目的1. 通过小鼠常压密闭缺氧实验,探讨白藜芦醇对机体耐缺氧能力的调控作用,为下一步白藜芦醇干预高原红细胞增多症大鼠实验奠定基础。2.建立高原红细胞增多症Wistar大鼠模型,探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对高原红细胞增多症的调控作用。3.研究补充白藜芦醇对高原红细胞增多症大鼠的调控作用,从血液学指标、抗氧化功能、免疫功能及模拟高原环境下机体摄氧能力方面探讨白藜芦醇对高原红细胞增多症的调控机制。4.基于蛋白质组学技术对实验结果进行生物信息学分析,揭示白藜芦醇改善高原红细胞增多症的关键调控分子,筛选白藜芦醇干预作用下差异表达蛋白,探索白藜芦醇调控高原红细胞增多症的分子生物学机制。方法1. 小鼠常压密闭缺氧实验,验证Res提高小鼠耐缺氧能力的作用效果雄性昆明种小鼠50只,体重20±2g,领养后适应喂养3天,按体重随机分为对照组、实验低、中、高组和阳性对照组,每组10只。各组小鼠每天灌胃相应水溶液0.5ml（低剂量组L:50mg/kg的Res;中剂量组M:100mg/kg的Res;高剂量组H:200mg/kg的Res;阳性对照组:90mg/kg的醋氮酰胺）,对照组每天灌胃相同体积的蒸馏水;每周称体重2次,灌胃2周后,进行常压密闭缺氧实验,将对照组和实验组小鼠分别放入250ml广口瓶里,瓶中盛有碱石灰10g,每瓶装1只小鼠,用凡士林对瓶盖进行密封,防止漏气,然后开始计时,以小鼠最终停止呼吸作为计时终点。记录小鼠在密闭瓶中的存活时间,然后取相应的组织,进行生化指标的检测。2. 建立高原红细胞增多症（HAPC）大鼠模型,探讨Res对HAPC的干预作用,为Res调控HAPC实验研究奠定基础。选用Wistar雄性大鼠60只,体重（200±20）g。根据血红蛋白和体重两项指标随机分为六组:正常组、模型对照组、Res低剂量组（100mg/kg）、Res中剂量组（200mg/kg）、Res高剂量组（400mg/kg）和阳性对照组（90mg/kg的醋氮酰胺）。建模方法:实验动物置于低压舱内,进行间断性减压低氧暴露（以15 m/s速度减压,3000m处停留10min,然后升至海拔5500m高度,维持8h/d,低氧处理结束后以20m/s速度恢复至海平面高度）,连续低氧暴露至高原红细胞增多症模型建立。HAPC大鼠模型建模成功后,对各组小鼠进行相应的灌胃干预,三个Res实验组分别灌胃100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg剂量的Res溶液1ml/d,阳性对照组灌胃90mg/kg的醋氮酰胺溶液1ml/d,正常对照组灌胃等量生理盐水1ml/d。实验动物体质量及血红蛋白（Hgb）每周进行一次动态检测,血红蛋白（Hgb）检测采用氰化法。动物处死前,测量体质量,采用10%水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,EDTA-K₂抗凝,取大鼠外周血分装备用,取心脏,肝肾等脏器液氮冻存备用。3.生化指标、血流变指标的检测,基于蛋白质组学技术,揭示白藜芦醇改善高原红细胞增多症的关键调控分子,筛选差异表达蛋白,探讨白藜芦醇对高原红细胞增多症调控的分子作用机制。利用血液粘滞度测定仪检测低、中、高切变率时的血液粘滞度;利用红细胞测定仪检测红细胞变形指数和聚集指数;利用HMX血细胞测定仪检测红细胞计数,白细胞计数,血红蛋白含量,红细胞压积,血小板,取大鼠心脏、脑、肝脏等组织,进行生化及蛋白质组的分析检测,基于蛋白质组学的高通量筛查能力,筛选出出影响大鼠血红蛋白含量及提高机体抗缺氧能力的差异蛋白,调控相关蛋白表达的关键因子,运用Western blot技术对筛选出的差异表达蛋白分子进行验证,确定白藜芦醇干预高原红细胞增多症的分子作用机制,为探讨Res干预高原红细胞增多症大鼠的作用机制提供新的思路。结果1.Res对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响:与空白对照组相比,Res中、高剂量组小鼠和醋氮酰胺阳性对照组小鼠抗缺氧存活时间明显延长（P<0.05）,Res中、高剂量组与阳性对照醋氮酰胺组之间无显著性差异,实验结果表明Res可延长小鼠常压密闭缺氧存活时间,提高小鼠的常压密闭抗缺氧能力。2. 在模拟海拔5500m高度,每天连续低氧处理8h,连续4w可致大鼠血红蛋白含量增加,与对照组相比,增加约25%,在此后的16w时间内,血红蛋白值基本处于稳态趋势,提示已成功建立了HAPC大鼠减压低氧模型。HAPC减压低氧模型大鼠红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞压积,血液粘滞度,红细胞聚集指数显著升高,血红蛋白含量达到高原红细胞增多症的诊断标准,而红细胞变形指数未发现明显改变。在对高原红细胞增多症大鼠进行白藜芦醇干预后,能显著降低HAPC模型大鼠的血红蛋白含量,红细胞压积、血液粘滞度、红细胞聚集指数,提高机体的抗氧化能力,减轻低氧暴露对机体的氧化损伤,并对机体的免疫功能具有一定的改善作用。3. 血浆蛋白质组学结果显示:血浆蛋白质组学分析结果不仅证实了缺氧时红细胞的过度增生,还揭示了其他重要的功能变化,如T细胞增殖和肌动蛋白细胞骨架组织的调节。Res在缓解HAPC方面发挥积极作用,干预后血红蛋白浓度明显降低,血小板含量明显增高,血小板水平的升高有助于改善缺氧环境下血流动力学指标,降低血液粘滞度。label-free蛋白质组学显示差异表达的蛋白质也表明Res可以逆转缺氧引起的蛋白质组模式的紊乱,Res可以调节细胞骨架组织蛋白的表达、辅因子代谢过程和红细胞发育过程,使其接近正常对照组水平。此外,Res能够下调参与急性炎症反应和凝血的蛋白表达,如Vwf和Serpinc1等蛋白均表达下调,这对于改善高原红细胞增多症的病情十分有利,改善机体的内缺氧状况,减少血栓的生成,有助于机体对于高原低氧环境的适应,有望开辟Res在高原医学领域的应用前景。结论1.Res能明显提高常压密闭缺氧小鼠的存活时间,表明Res能够提高机体耐缺氧能力。2.本研究通过模拟海拔5500m高原环境,成功建立HAPC大鼠动物模型,并进行后续Res干预研究,实验结果表明:Res能够有效的降低HAPC大鼠的血红蛋白浓度,改善血液流动学指标,提高大鼠的抗氧化能力,改善大鼠的免疫功能,这些指标的改善对于减轻HAPC的病症是十分有力的。3. Res对高原红细胞增多症大鼠血清蛋白质组学结果表明:Res可以下调hbb蛋白的表达,降低急性炎症反应和凝血相关蛋白的表达,而且不会诱发和加重HAPC,这些指标的改善都有利于HAPC症状的减轻,降低HAPC的危害。基于蛋白质组学技术揭示了白藜芦醇改善高原红细胞增多症的关键调控分子和关键蛋白分子,从分子生物学角度阐述了白藜芦醇调控高原红细胞增多症的作用机制,具有很好的指导性,为进一步研究HAPC干预机制提供新的研究方向和思路,有望开辟Res在高原医学领域新的应用。