论文部分内容阅读
目的:内皮祖细胞的衰老是动脉粥样硬化形成、发展过程中的初始变化和主要环节,阐明EPC衰老机制并找出干预靶点对逆转EPC衰老具有重要意义。MeCP2是广泛表达于机体各组织细胞的一种转录因子,在许多病理情况下MeCP2表达失调,但MeCP2对EPC功能的影响目前尚不清楚,本文旨在探讨MeCP2是否通过抑制SIRT1来影响EPC功能,并进一步探讨MeCP2对SIRT1的调控机制。方法:从健康产妇脐血中提取分离培养EPCs,并对其进行细胞鉴定。将第三代内皮祖细胞持续传代复制培养和用适当浓度H2O2处理来诱导衰老分别作为复制性衰老模型和应激性早衰模型。CCK-8检测EPC在受H2O2刺激下的存活状况,细胞周期实验检测其增殖能力,Transwell小室、划痕实验检测迁移能力,基质胶小管观察体外血管生成能力,流式凋亡实验检测细胞凋亡。免疫荧光检测MeCP2的细胞定位,Western Blot检测SIRT1、MeCP2的蛋白表达水平,qPCR检测MeCP2和SIRT1的mRNA表达水平。腺病毒介导的转染用来过表达或沉默MeCP2,亚硫酸氢钠甲基化测序测定SIRT1启动子的甲基化水平。染色质免疫共沉淀实验检测MeCP2、H3K9me2与SIRT1启动子的作用关系。结果:原代培养的EPC镜下观察呈卵石铺路样形态,能摄取Ac-LDL并结合UEA-1,高表达CD133、CD34和VEGFR-2。细胞反复传代培养至25代表现出细胞生长停滞状态,40μM H2O2处理24小时后再更换新鲜培养基继续培养3天也表现出与25代细胞相同的衰老状态。H2O2呈剂量依赖地降低细胞存活率。随EPC衰老其功能下降,MeCP2表达水平上调,并与细胞的复制代数呈正相关,而SIRT1表达水平下调,并与细胞的复制代数负性相关。MeCP2过表达时加剧了衰老细胞的功能下降,SIRT1表达水平也下降,MeCP2沉默时SIRT1表达水平上调。MeCP2过表达时,SIRT1启动子CpG甲基化程度增加,MeCP2蛋白、组蛋白H3K9me2在SIRT1启动子区域高度密集。结论:MeCP2加剧衰老内皮祖细胞的功能障碍,其机制可能是通过促进MeCP2对SIRT1 DNA甲基化、组蛋白H3K9二甲基化,从而抑制SIRT1转录来实现的。