胃癌、结直肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，在我国约占恶性肿瘤总发病率的1/4。已经知道，错配修复基因的突变是遗传性非息肉性结直肠癌(hereditarynonpolysis colorectal cancer，HNPCC)发病的直接原因，错配修复基因的突变分析是目前被广泛接受的遗传性肿瘤症状出现前的基因诊断之一。在胃癌高发的东亚人群，部分家族性胃癌的发病亦与错配修复基因的遗传性突变有关，同时在散发性胃癌、结直肠癌患者中亦频繁检出错配修复基因的变异，构成消化道肿瘤发病的风险因素。错配修复基因突变数据库资料显示，在已检出的错配修复基因的胚系突变中，超过90％发生于MSH2和MLHI基因。而其中三分之一为错义突变，若考虑在非典型病例检出的“低度外显”突变和多态位点，错义突变的检出率将大大高于这一比例。但是在缺乏可靠的功能评估体系的情况下，对于MSH2和MLH1基因错义突变的病理作用难以确认，这严重影响了后续的基因诊断效率和遗传咨询工作。 本研究由二部分组成： 1．胃肠肿瘤患者错配修复基因MSH2突变的病例—对照及生物信息学分析 2．胃肠肿瘤患者中错配修复基因MLH1频发突变及其功能评估的研究 第一部分：胃肠肿瘤患者错配修复基因MSH2突变的病例-对照及生物信息学分析 在突变筛查和分子流行病学调查的基础上，结合病例-对照和生物信息学分析，评估187例中国疑似HNPCC患者错配修复基因MSH2错义突变的意义。 发现MSH2基因外显子7区突变频率增加，相对于正常对照组(1/112，0.89％)，结直肠癌(CRC)患者组(6/82，7.32％)及胃癌(Gc)患者组(8/105，7.62％)与其差别均有统计意义(P＜0.05)，优势比各为8.76及9.15。提示在研究的人群中，MSH2基因外显子7区突变与胃肠肿瘤患病风险间存在相关性。 进一步分析提示该区的c．1168C＞T(p.Leu390Phe)突变频发，在年轻的散发CRC及GC病人中显示出与疾病的相关性，优势比分别为10.97及17.15。(p.Leu390Phe)、c.1255C＞A(p.Gln419Lys)及c.1261C＞A(p.Leu421Met)突变，以及外显子3区的c.518T＞G(p.Leu173Arg)突变可能与胃肠肿瘤易感有关，而该基因中c.505AYG(p.Ile169Val)、c.1221C＞G(p.Leu407Leu)及c.1223A＞G(p.Tyr408Cys)突变极可能只是不改变功能的多态性变异。 总之，本研究结果显示MSH2基因外显子7区域是中国胃肠肿瘤患者基因突变热点，其中c.1168C＞T(p.Leu390Phe)可能是中国胃肠肿瘤发生的高风险因子。 第二部分：胃肠肿瘤患者中错配修复基因MLH1频发突变及其功能评估的研究 发生于错配修复基因MLH1的胚系突变是引起HNPCC的主要原因之一，而其中三分之一是错义突变。鉴于现有分析手段的限制，对于这类突变的病因学作用往往难以确定。突变分析资料表明，不同种族、人群之间基因变异谱可能存在明显差异：部分突变在中国或东亚人群中频繁检出，但可能鲜见于欧美人群；反之亦然。这构成不同人群发病状况差异的遗传学基础。本研究以中国及东亚人群胃肠肿瘤患者中MLH1基因特征性错义突变为分析靶点，开展MLH1蛋白变异体的功能分析，确定这些频发的错义突变与胃肠肿瘤发病的相关性。期望建立基因错义突变功能评估的实验体系。 纳入研究的共有10个突变体：S46I、G65D、G67R、R217C、V384D、Q542L、L549P、L574P、P581L及Q701K，采用酵母双杂交分析以及免疫共沉淀分析，从突变对MLH1蛋白与PMS2蛋白相互作用影响角度进行分析，并结合同源序列比对分析、三维蛋白结构模拟以及病例—对照分析，综合评估突变的功能意义。 结果显示，四个羧基端突变Q542L、L549P、L574P以及P581L，在酵母双杂交分析以及免疫共沉淀分析中均显示丧失了MLH1蛋白与PMS2蛋白的结合活性，故认为是病理性突变。四个氨基端突变S46I、G65D、G67R以及R217C在免疫共沉淀分析中维持MLH1蛋白与PMS2蛋白正常的结合作用，但在酵母双杂交分析中部分或全部失去活性。我们从核定位角度提出，这些突变可能降低了MLH1/PMS2二聚体进入细胞核的效率，从而MMR功能可能降低或受阻，因此它们与胃肠肿瘤间也存在某种相关性。以多态形式出现于中国和东亚人群的MLH1基因V384D和Q701K，导致了MLH1与PMS2蛋白作用降低，因此将其归为部分失去功能的突变，它们可能提高突变携带者罹患胃肠肿瘤的风险。 总之，本研究评估了一些以前没有确定的东亚人群中MLH1基因错义突变的功能后果，结果对于中国和东亚人群胃肠肿瘤的分子诊断和发病风险评估将发挥作用。 本论文研究工作表明： 1．三维蛋白结构模拟可应用于MSH2基因错义突变的功能分析。 2．酵母双杂交和免疫共沉淀分析系统可有效确定MLH1基因错义突变对其基因产物(蛋白质)间相互作用的影响。 3．MSH2基因外显子7区突变与中国胃肠肿瘤患病风险间存在相关性。 4．MSH2基因外显子7区c．1168C＞T(p．Leu390Phe)突变频发，在中国年轻的散发CRC及GC病人中显示出与疾病的相关性。 5．MSH2基因外显子7区c．1168C＞T(p．Leu390Phe)、c．1255C＞A(p．Gln419Lys)及c．1261C＞A(p．Leu421Met)突变，以及外显子3区的c．518T＞G(p．Leu173Arg)突变可能与胃肠肿瘤易感有关，而该基因中c．505A＞G(p．Ilel69Val)、c．1221C＞G(p．Lsu407Leu)及c．1223A＞G(p．Tyr408Cys)突变极可能只是不改变功能的多态性变异。 6．MLH1四个羧基端突变Q542L，L549P，L574P以及P581L使MLH1蛋白与PMS2蛋白结合完全丧失，极可能是病理性突变。 7．MLH1四个氨基端突变S46I、G65D、G67R以及R217C并未影响MLH1蛋白与PMS2蛋白结合作用，但是极可能降低其进入核内发生MMR作用的能力，因此它们与胃肠肿瘤间也存在某种相关性。 8．以多态形式出现于东亚人群的MLH1 V384D突变以及Q701K突变部分影响MLH1蛋白功能，可能提高突变携带者罹患胃肠肿瘤的风险。