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研究证明将多糖与蛋白质载体共价偶联形成结合疫苗，使多糖由胸腺非依赖性抗原转化为胸腺依赖性抗原，能够增强多糖的免疫原性。国内研制结合疫苗多采用破伤风类毒素(TT)作为载体蛋白，TT本身作为疫苗已经大范围接种婴幼儿，人群体内已预存有针对载体蛋白TT的高滴度特异性抗体，随着更多多糖结合疫苗的临床应用，相同的载体蛋白将重复、多次地进入婴幼儿体内，势必造成其体内载体蛋白的过载而产生载体诱导的表位抑制现象。因此理想的载体蛋白是研制多糖结合疫苗的关键。本实验利用基因工程技术，人工构建了一复合通用CD4+T辅助细胞表位基因Pep10，并在大肠杆菌中对Pep10基因进行了表达、纯化。将重组Pep10作为蛋白载体，制备了A群脑膜炎球菌多糖结合物，并对其免疫原性和载体蛋白诱导的免疫抑制现象进行了初步探讨。
第一部分：复合通用CD4+T辅助细胞表位基因由10个CD4+T辅助细胞表位组成(人工合成的T细胞表位PADRE；破伤风类毒素p23、p32、p21、p30、p2；白喉类毒素DT1、DT2、CRM1、CRM2)，表位之间由柔性氨基酸赖氨酸和甘氨酸连接，共645个核苷酸组成。由DNAwork2.0软件设计并人工合成20条55个碱基的寡核苷酸序列，利用套叠PCR技术人工合成全基因序列，并克隆至PUC19载体构建克隆质粒PUC19-Pep10，测序证实成功构建了复合通用CD4+T辅助细胞表位基因，为研究细菌多糖结合疫苗提供了新的载体表位。
第二部分：构建复合通用CD4+T辅助细胞表位基因的原核表达载体PQE30-Pep10。以BamHI和HindIII酶切质粒PUC19-Pep10，回收650bp目的DNA片段，插入原核表达载体PQE30中，获得重组质粒PQE30-Pep10，将其转化入大肠杆菌M15后进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE分析，亲和层析、复性后获得重组蛋白Pep10。将Pep10和TT分别免疫雌性Balb/c小鼠，分离免疫血清及TT免疫小鼠脾脏单个核细胞，以间接ELISA法和流式细胞术分别比较Pep10和TT的免疫原性和淋巴细胞增殖效应。SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子量约为23KDa，表达量在41％以上，主要以包涵体形式表达，纯化后纯度达94％以上、共获得42mg重组蛋白。其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当，增殖指数分别为4.216和4.736，而免疫原性远低于TT，特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1:15758.65和1:67558.81(P<0.05)。结果表明表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性，其可能作为一种新型载体蛋白用于细菌多糖结合疫苗的研制。
第三部分：采用两种方法制备A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)-重组蛋白Pep10结合物。方法一：将A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)经溴化氰(CNBr)活化后，共价接合己二酰肼(ADH)手臂获得GAMP-ADH衍生物，衍生率为1.28％。衍生物在碳二亚胺(EDAC)催化下与重组蛋白Pep10偶联制备结合物GAMP-ADH-Pep10。结合物经Sepharose4FF凝胶过滤层析纯化后，收集结合物组份分别测定多糖和蛋白质含量及KD值，计算得出多糖/蛋白质比值为0.97，KD值为0.11；免疫双扩散试验证明结合物能够与抗A群流脑多糖单克隆抗体产生沉淀线，说明结合物偶联成功，并具有良好的抗原性。
方法二：将A群脑膜炎球菌多糖(GAMP)经酸水解后，获得平均聚合度(avDP)为9.21的寡糖混合物，随后在NH4Cl和NaBH3CN作用下进行氨化反应，氨化率为38％；氨化寡糖经SephadexG-15纯化后共价结合SIDEA获得GAMP-SIDEA衍生物，衍生率为47％，衍生物经1-4dioxane沉淀后与重组蛋白Pep10在Ni-NTAsuperflow亲和层析柱上固相结合，以含有250mM咪唑的100mM磷酸钠缓冲液竞争洗脱而获得结合物GAMP-SIDEA-Pep10，计算结合物中寡糖和蛋白含量，得寡糖/蛋白比值为0.62。
取6周龄雌性Balb/c小鼠60只，随机分A～F共6组，每组10只。A～D组于第0、15、29天分别腹部皮下注射100μl(含GAMP2.5μg)的GAMP、GAMP-ADH-TT、GAMP-ADH-Pep10、GAMP-SIDEA-Pep10，并于第一1、14、28、45天眼眶采血；E、F组先于-30天分别注射100μl(含蛋白50μg)的TT和Pep10，再按上述程序注射相应的结合物并采血，用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GAMPIgG抗体水平，并分析载体诱导的免疫抑制率。抗体检测结果显示，实验中制备的结合物免疫小鼠后诱生的抗GAMP血清IgG抗体水平高于多糖单独免疫产生的抗体水平，并能形成免疫记忆。重组蛋白Pep10诱导的免疫抑制率低于TT诱导的免疫抑制率。