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研究背景：血栓性疾病严重威胁着人类的健康,血栓形成机制的研究是医学科学领域重大课题之一。动脉血栓是造成90%以上的心肌梗死、80%脑卒中的主要原因,动脉栓塞性心血管疾病一直是发达国家首位的死亡原因。血小板在血栓形成特别是动脉血栓形成中起着重要作用。因此抗血小板治疗是预防和治疗血栓性疾病的重要措施。临床广泛使用的经典抗栓药物如第一代的阿司匹林,噻氯吡啶等,可相应地抑制血小板活化过程中,由血栓烷A2(TXA2)和二磷酸腺苷(ADP)介导的单一步骤,具有预防血栓形成的作用,第二代血栓性药物是以阻断血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP) Ⅱb/Ⅲ a与纤维蛋白原(Fg)结合为主要机制。近年来针对动脉血栓形成早期阶段的研究,其中胶原-血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)-GP Ⅰ b轴各分子间相互作用的分子机制及抗血栓治疗新靶点的研究已成为血栓与止血领域中的热点和前沿科学问题之一。由于针对胶原-vWF-GP Ⅰ b轴来阻止血小板的早期粘附和活化,具有更早、更好的抗栓活性,并减少出血危险性,形成新一代的抗栓药物,因此具有更为广阔的应用前景。赵益明等之前报道了一株特异性针对vWF-A3区的单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb) SZ-123,该单抗不仅能抑制vWF与胶原的结合,还能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(血小板膜糖蛋白GPIb结合于vWF-A1区),这一结果提示vWF-A3区胶原结合部位可能动态调节vWF-A1区的功能。此外,SZ-123抗体已经证实在猴体内具有抗栓活性。抗vWF-A3区特异性单抗SZ-123不但能够抑制vWF-A3区与胶原结合,而且抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。现已排除了SZ-123与vWF-A1区的作用,有假设提出是由于mAb SZ-123与vWF-A3作用的同时影响了vWF-A1区的空间构像,改变了其空间结构,进而影响了vWF-A1区与血小板的结合,从而产生抗栓的作用。因此,制备分子量较小的单链抗体,更有利于从蛋白质空间结构上解释SZ-123的作用机制,这也是制备SZ-123单链抗体的重要意义所在。目的：本研究旨在利用基因工程手段制备相对于抗vWF-A3区特异性单抗SZ-123分子量较小的单链抗体,通过原核和真核表达以及体外生物学功能实验验证其是否具有与SZ-123相似的功能活性,从而从蛋白质空间结构上解释单抗SZ-123与vWF不同功能结构域相互作用的独特机制,为下一步鼠源单抗SZ-123的人源化和更深一步探讨单抗SZ-123的抗栓机制提供理论依据,同时也为将来开发基于单抗SZ-123的抗栓药物奠定基础。方法：(1)首先用RT-PCR方法扩增单抗SZ-123重链和轻链可变区基因,并用Over-lap PCR方法将重链和轻链与linker序列拼接成单链抗体(SZ-123ScFv),构建SZ-123ScFv原核表达载体并转化到大肠杆菌,完成SZ-123ScFv的原核表达,对其浓缩,然后用ELISA, Western blot等方法验证SZ-123ScFv的免疫原性。(2)首先用RT-PCR方法扩增单抗SZ-123重链和轻链可变区基因,并用Over-lapPCR方法将重链和轻链与linker序列拼接成单链抗体(SZ-123ScFv),构建单抗SZ-123ScFv基因真核表达载体pSectag/SZ-123ScFv,经转染和筛选后,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达,完成SZ-123ScFv的真核表达,对其浓缩,然后用SDS-PAGE, Western Blot等方法验证SZ-123ScFv的免疫原性。(3)通过胶原结合抑制试验验证SZ-123单链抗体的功能活性：以人胎盘Ⅲ型胶原包板,加入vWF纯品后,再加入原核与真核表达的浓缩纯化后的蛋白孵育,最后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的兔抗人vWF多克隆抗体,四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)显色后,酶标仪读取吸光度值(OD)。(4)通过瑞斯托霉素诱导的血小板聚集实验验证SZ-123单链抗体的功能活性：抽取健康人柠檬酸钠抗凝的静脉血,分离得到富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。加入瑞斯托霉素诱导,在血小板聚集仪上检测其抑制血小板聚集功能。结果：SZ-123ScFv的原核表达：VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-123ScFV基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的20%。经过变性和复性后,获得具有生物活性的单链抗体片段。其有一定的抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能(P<0.05),差异具有统计学意义。SZ-123ScFv的真核表达：将780bp拼接后的ScFv插入真核表达载体pSectag-123ScFv,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag/SZ-123ScFv,将pSectag/SZ-123ScFv转染到中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary, CHO)后获得目的蛋白表达,SDS-PAGE和Western Blot检测表明目的蛋白分子量约为45kD。生物学功能试验结果显示SZ-123ScFv能够剂量依赖性抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合,且能抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。与单抗SZ-123相比,其抑制作用有所降低。结论：(1)成功地构建了SZ-123单链抗体基因原核表达载体PET20b(+)-123ScFv,导入大肠杆菌中,经诱导表达完成了其原核的表达。该小分子抗体具有特异结合vWF-A3区的能力。(2)成功地构建了SZ-123单链抗体基因真核表达载体pSectagSZ-123ScFv,并转染到CHO细胞后,筛选出转染成功的单克隆细胞,完成了其真核的表达。(3)原核表达的单链抗体有较弱的抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集功能。真核表达的单链抗体具有抑制胶原与vWF结合和抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的功能,但与单抗SZ-123相比,其活性有所下降。(4)SZ-123单链抗体的制备和生物学功能研究有助于从蛋白质空间结构上解释单抗SZ-123的独特作用,同时也为进一步开发基于单抗SZ-123的抗栓药物以及为更加深入的研究血栓形成的机制和开发新的抗血栓药物奠定了基础。