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【背景】谷氨酸通过谷氨酸受体包括NMDA受体，在中枢神经系统中发挥重要作用。而突触前膜释放大量谷氨酸时，谷氨酸可在突触间隙中聚集，形成NMDA受体的过度激活，引起突触后膜Ca2+内流增加，引发Ca2+超载，由此造成细胞损伤甚至死亡，被称为兴奋性神经毒。外源性给予NMDA也可造成神经损伤，用于研究多种神经损伤过程，如脑缺血、神经退行性病变等，而且该模型是目前用于研究神经损伤最常用、最具有临床意义的一种模型。 SIRT1是一种NAD+依赖的脱乙酰基酶，可作用于组蛋白和多种非组蛋白，通过其去乙酰化修饰作用，调节基因转录、染色体稳定性和靶蛋白活性，进而参与细胞衰老、心血管疾病、肿瘤发生发展、物质代谢等一系列生理病理过程的调节。近年来，有关SIRT1的神经保护作用受到人们越来越广泛的关注。但SIRT1在NMDA诱导的兴奋性神经毒中是否发挥保护作用还不明确。因此，本研究利用NMDA诱导的兴奋性神经毒模型，通过转染SIRT1观察其在NMDA引起的神经损伤中的神经保护作用。 【目的】利用神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y建立NMDA兴奋性神经毒模型，分别观察（1）NMDA引起的细胞损伤、SIRT1mRNA水平、SIRT1蛋白表达以及SIRT1去乙酰化酶活性的改变；（2）SIRT1高表达拮抗NMDA所致细胞损伤的作用；（3）Ca2+螯合剂BAPTA-AM抑制NMDA引起的细胞损伤、SIRT1mRNA水平、SIRT1蛋白表达以及SIRT1去乙酰化酶活性的改变。 【方法】在NMDA（500μmol/L，2h）诱导的神经毒模型基础上，利用脂质体Lipofectamine2000介导的方法将SIRT1基因转染到SH-SY5Y细胞中，使其高表达，然后应用CCK-8分析（细胞活力检测）、乳酸脱氢酶（LDH）检测（细胞损伤检测）、Calcein-AM/PI染色（活细胞计数）、RealTimePCR、Western-blot、SIRT1去乙酰化酶活性分析等方法，分别检测细胞活力、细胞损伤程度、活细胞数量、SIRT1mRNA水平、SIRT1蛋白表达以及SIRT1去乙酰化酶活性。 【结果】第一部分实验：1、CCK-8检测结果表明，NMDA引起SH-SY5Y细胞活力下降53.6％（P<0.05）；MK-801可以拮抗NMDA引起的活力下降（P<0.05）。 2、LDH检测结果表明，NMDA使细胞LDH释放量增加59.45%（P<0.05）；MK-801可以抑制NMDA引起的LDH释放增加（P<0.05）。3、Calcein-AM/PI染色结果显示，NMDA使活细胞数减少50.85%（P<0.05）；MK-801可以拮抗NMDA减少的细胞数（P<0.05）。4、RealTimePCR检测结果显示，NMDA使细胞SIRT1mRNA水平下降45.32%(P<0.05)；MK-801可以取消NMDA对mRNA的影响。5、WesternBlot结果证实，NMDA使细胞SIRT1蛋白表达下调40%（P<0.05）；MK-801可以拮抗NMDA引起的SIRT1表达下调（P<0.05）。6、SIRT1去乙酰化酶活性检测结果显示，NMDA使SIRT1去乙酰化酶活性降低45.22%（P<0.05）；MK-801可以抑制NMDA引起的SIRT1酶活性下降（P<0.05）。 第二部分实验：1、RealTimePCR检测结果显示，SIRT1高表达组的SIRT1mRNA水平明显上调（P<0.05）；Ca2+螯合剂BAPTA-AM（100μmol/L）可以取消NMDA引起的mRNA水平下调（P<0.05）。2、WesternBlot结果证实，SIRT1高表达组的SIRT1蛋白表达含量明显增加（P<0.05）；BAPTA-AM同样可以拮抗NMDA引起的SIRT1蛋白表达下调（P<0.05）。3、SIRT1去乙酰化酶活性检测结果显示，SIRT1高表达拮抗NMDA的作用，使其降低的酶活性恢复60.34%（P<0.05）；而SIRT1抑制剂Sirtinol（50μmol/L）可以抑制SIRT1高表达引起的酶活性升高（P<0.05）；BAPTA-AM拮抗NMDA引起的SIRT1酶活性降低（P<0.05）。4、CCK-8检测结果表明，SIRT1高表达使NMDA组下降的细胞活力恢复60.95%（P<0.05）；Sirtinol可以拮抗SIRT1高表达恢复的细胞活力（P<0.05）；BAPTA-AM抑制NMDA所致的细胞活力下降（P<0.05）。5、LDH检测结果表明，SIRT1高表达使NMDA引起的LDH释放量减少24.26%（P<0.05）；Sirtinol抑制SIRT1高表达引起的LDH释放减少（P<0.05）；BAPTA-AM拮抗NMDA引起的LDH释放增加(P<0.05)。6、Calcein-AM/PI染色结果显示，SIRT1高表达使NMDA组的细胞数增加54.02%（P<0.05）；而Sirtinol可取消SIRT1高表达引起的细胞数增加（P<0.05）；BAPTA-AM则抑制NMDA减少的细胞数（P<0.05）。 【结论】在NMDA诱导的兴奋性神经毒中，（1）NMDA可能通过下调SIRT1mRNA水平、SIRT1蛋白表达，使其去乙酰化酶活性降低，从而引起神经损伤；（2）SIRT1高表达可能通过增强其去乙酰化酶活性，促进细胞存活，从而拮抗NMDA引起的神经损伤；（3）Ca2+螯合剂BAPTA-AM可能通过上调SIRT1mRNA、SIRT1蛋白，增强其去乙酰化酶活性，从而拮抗神经损伤；（4）由于已知NMDA引起的Ca2+内流是导致其兴奋毒性作用的关键因素，因此我们推测：NMDA通过介导Ca2+内流，使SIRT1mRNA水平、SIRT1蛋白表达下调，去乙酰化酶活性降低，最终引起神经损伤。