肝癌是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤,其发生和发展依赖于许多遗传或者表观遗传学的变化,过程极为复杂。随着对于肿瘤分子生物学认知的扩展,人类在肝癌早期的诊断治疗以及开发新的抗癌药物和手段等领域取得显著进展。考虑到单一药物或者手段难以达到足够的治疗效果,近年来,将抗癌药物与小干扰RNA (Small interfering RNA, siRNA)联用的方式备受瞩目。siRNA可通过在细胞质中形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)引起序列特异性基因沉默效应,进而抑制细胞周期、增殖、血管生成或者其他细胞通路的进程,对于治疗特定类型肿瘤具有良好潜力。将药物与siRNA联用可使两者到达相同靶细胞发挥协同作用、抑制肿瘤发展。非病毒纳米载体为药物与siRNA联用提供了优良的平台,研究热点在于将两者装载于同一载体中进行共递送。构建共递送载体的挑战在于将理化性质截然不同的药物和siRNA以较高的包封率进行装载,载体在体循环中保持稳定并在肿瘤部位实现定位释放发挥作用。脂质体作为最成功的纳米载体之一已经过多个临床研究证实。脂质体可同时装载亲水和疏水药物,并且其制备工艺简单、具有放大生产的能力。因此,本课题采用阳离子脂质体(Cationic liposomes, CL)作为载体,包裹小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib, Sf),得到载Sf阳离子脂质体Sf-CL,继而通过静电作用与siRNA结合,形成Sf与siRNA共装载的阳离子复合物SiSf-CL。为实现药物和siRNA在肿瘤部位的定位释放,将在生理条件下(pH 7.4)带负电的pH敏感材料O-羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl-chitosan, CMCS)吸附到共装载药物和siRNA的SiSf-CL上,获得pH敏感Sf和siRNA共载脂质体CMCS-SiSf-CL。课题选择VEGF-siRNA作为治疗基因,制备共装载VEGF-siRNA和Sf的pH敏感脂质体,期望通过两者共递送达到协同抑制VEGF表达,从而增强对肝癌的治疗效果,为肝癌的有效治疗提供新的思路。主要研究内容和结果如下：1.索拉非尼阳离子脂质体的制备与表征建立SfHPLC含量检测方法。结果表明Sf在测定浓度范围内线性良好,精密度、回收率均符合要求。采用溶解-高速离心法分离脂质体和游离Sf,以HPLC测定脂质体中Sf含量和包封率。采用薄膜分散法制备载Sf阳离子脂质体Sf-CL,以包封率为评价指标,对Sf与DOPE摩尔比,Cholesterol与DOPE摩尔比,DOTAP与DOPE摩尔比等三个影响因素进行考察,得到最优处方Sf与DOPE摩尔比为1：6.5,Cholesterol与DOPE摩尔比为1：2,DOTAP 与 DOPE摩尔比为1：3。三批样品的平均包封率为90.36%+0.63%,载药量为5.19%+0.035%,粒径为147.0+2.2nm,多分散指数PDI为0.135士0.027,Zeta电位为33.5±1.7 mV,同法制得的空白阳离子脂质体CL的粒径为122.5+2.6nm,PDI为0.104±0.006,Zeta电位为38.0±2.1 mV。CL和Sf-CL形态圆整,分散性良好。2.pH敏感共载索拉非尼和siRNA脂质体的制备与表征首先将Sf-CL与Cy3-siRNA按照CL与siRNA不同质量比孵育后得到Sf与siRNA共载阳离子脂质体SiSf-CL。采用琼脂糖凝胶电泳和激光粒度仪筛选最佳比例。结果表明,当CL/siRNA质量比为20：1时,siRNA可被完全压缩,粒径为164.5±3.1 nm,Zeta电位为16.5±2.6 mV。将SiSf-CL与CMCS按照CMCS与siRNA不同质量比孵育后得到CMCS修饰的共载阳离子脂质体CMCS-SiSf-CL,最佳处方CMCS/siRNA质量比为3.8：1,粒径和Zeta电位分别为200.1±7.9 nm和-10.6±1.0 mV。制得的CMCS-SiSf-CL可在12h内保护siRNA不被血清降解,4 h内保护siRNA不被RNA酶降解；在37℃、10%血浆溶液中孵育120 min粒径无明显变化；在4℃冰箱放置28天粒径无明显变化,表明CMCS-SiSf-CL具备定的生物稳定性和物理稳定性。采用酸碱滴定法测定CMCS的pH敏感性,其在pH 6.24处滴定曲线出现平台期。采用动态膜透析法考察CMCS-SiSf-CL 和 CMCS-Sf-CL在不同pH条件下的体外释放行为。结果表明,CMCS-SiSf-CL 和 CMCS-Sf-CL在pH 7.4释放介质中72 h的累积释放率分别为26.08%±3.19%和31.75%士2.09%,在pH 6.5释放介质中72 h的累积释放率分别为34.52%±2.16%和40.78%±4.07%,说明CMCS修饰的载体具备一定的pH敏感性(P<0.05)。3.pH敏感共载索拉非尼和siRNA脂质体的siRNA体内外分布和索拉非尼抗肿瘤能力研究以HepG2细胞作为体外实验模型考察载体的细胞摄取和细胞毒性。采用流式细胞仪和荧光显微镜考察Cy3-siRN A在HepG2细胞内不同pH条件下的细胞摄取情况。流式细胞仪测定结果表明,pH 6.5条件下CMCS-SiSf-CL的细胞摄取率(58.18%+12.83%)为pH 7.4条件下摄取率(27.69%±4.10%)的2.1倍(P<0.05),且与pH 7.4条件下的阳离子复合物SiSf-CL (55.49%±8.47%)以及商品化Lipofectamine-2000/siRNA复合物(66.93%+2.52%)的摄取率相当,表明在模拟肿瘤微酸性环境的条件下,CMCS可发生电位逆转从载体表面完全脱落,暴露出的SiSf-CL可有效入胞,而游离siRNA几乎不能被细胞摄取,与荧光显微镜观察结果相符合。采用MTT法考察Sf作用于HepG2田胞24 h后的细胞毒性。结果表明,空白载体CMCS-CL无明显细胞毒性,游离Sf, Sf-CL, CMCS-Sf-CL, CMCS-SiSf-CL对于HepG2的细胞毒性均呈现一定的剂量依赖性,相应的半数抑制浓度ICso值分别为12.16±181μM,7.80±1.48μM,11.82±0.38 μM,11.44±0.83μM,空白载体CMCS-CL无明显细胞毒性。采用Cy5-siRNA考察载体在肿瘤区域的蓄积情况。小动物成像和肿瘤组织冰冻切片结果表明CMCS-SiSf-CL可有效递送siRNA至肿瘤部位,而游离siRNA无肿瘤分布。采用荷H22肿瘤昆明小鼠模型考察Sf载体的抑瘤能力,尾静脉注射4.5 mg/kg的游离Sf,Sf-CL,CMCS-Sf-CL以及空白载体CL和CMCS-CL,每三天给药一次,给药周期19天(总共给药6次)。结果显示,相对于生理盐水组,Sf-CL和 CMCS-Sf-CL可显著抑制肿瘤生长(P<0.01),且CMCS-Sf-CL与游离Sf存在差异(P<0.05),表明Sf-CL和CMCS-Sf-CL可将Sf递送至肿瘤发挥抑制作用。HE染色图片显示给药后小鼠主要脏器未发现明显病理学改变。4.pH敏感共载索拉非尼和siRNA脂质体体内外共递送研究以Cy3-siRNA和Coumarin 6代替siRNA和Sf,采用激光共聚焦显微镜考察CMCS修饰Cy3-siRNA/Coumarin 6共载脂质体在二维培养HepG2细胞中的荧光分布。结果表明,CMCS修饰共载脂质体在pH 7.4和pH 6.5条件下均能将模型药物递送入胞,pH 6.5条件下的共递送能力高于pH 7.4条件下的共递送能力。入胞的Cy3-siRNA在3h即能从溶酶体逃逸。构建体外三维培养HepG2肿瘤球模型,采用激光共聚焦显微镜拍摄共载脂质体在肿瘤球中渗透情况。孵育5h后结果显示,pH 6.5条件下CMCS修饰共载脂质体可递送至肿瘤球内部约107.8 mm处,pH 7.4条件下CMCS修饰共载脂质体可渗透至肿瘤球内部约84 mm,而在同一深度Z轴扫描中,pH 6.5条件下肿瘤球断层面的叠加荧光强度明显高于pH7.4条件下的荧光强度,证明CMCS修饰共载脂质体在模拟肿瘤微酸性条件下中能实现良好的肿瘤球渗透能力。体内共递送实验以Cy5-siRNA代替siRNA,小鼠肿瘤组织冰冻切片结果表明,CMCS修饰Cy5-siRNA/Coumarin6共载脂质体可将两者成功递送至肿瘤部位。5.pH敏感共载索拉非尼和VEGF-siRNA脂质体体外抑制肝细胞癌研究以VEGF-siRNA为治疗基因,考察载体在高表达VEGF的HepG2细胞中的抑制能力。以Realtime PCR筛选并确定VEGF-siRNA的转染剂量为100 nM。固定Sf终浓度28μM, siRNA终浓度100 nM,比较各组单载或者共载载体对于HepG2细胞VEGF基因水平的沉默作用(48 h)。结果显示,游离VEGF-siRNA组、游离Sf组VEGF mRNA相对表达量分别为108.84%±33.04%和78.31%士18.18%,基因沉默效果较低；pH 7.4条件下单载Sf组CMCS-Sf-CL,单载VEGF-siRNA组C MCS-Si-CL,共载VEGF-siRNA和Sf阳离子脂质体组SiSf-CL, pH敏感共载VEGF-siRNA和Sf脂质体组CMCS-SiSf-CL组VEGF mRNA表达量分别为73.12%±14.99%,68.93%±3.91%,35.29%±12.77%,66.31%士5.56%,即与游离基因和单载载体相比,共载载体可发挥一定的基因沉默作用(P<0.05),并且在模拟肿瘤微酸性pH 6.5条件下,CMCS-SiSf-CL组的VEGF mRNA表达量为38.41%±2.72%,低于pH 7.4条件下的表达量(P<0.05),进一步表明CMCS修饰的脂质体具有良好的pH敏感性,在肿瘤微酸性条件下CMCS可脱落,暴露阳离子SiSf-CL,促进入胞,将siRNA和Sf释放到细胞质中发挥基因沉默作用。Western Blot结果与Realtime PCR趋势基本一致。利用MTT法分别考察各给药组对于HepG2细胞活力的影响,结果表明Sf对HepG2细胞活力具有抑制作用,VEGF-siRNA在转染过程中对于细胞活力几乎没有影响。细胞凋亡结果显示,除游离VEGF-siRNA和CMCS-NCsi-CL,其他各给药组均能引起细胞早期凋亡,并且SiSf-CL和pH6.5条件下CMCS-SiSf-CL的细胞凋亡率更高(分别为38.59%和36.16%)。细胞周期测定结果显示,Sf和VEGF-siRNA联用对细胞周期无明显影响。综上,CMCS修饰的阳离子脂质体能有效共装载Sf和siRNA,具有一定的pH敏感性,可借助EPR效应被动靶向到肿瘤组织,将Sf和siRNA共递送至肿瘤区域,实现肿瘤微环境的定位释放,提高Sf和siRNA的入胞能力和抗肿瘤能力,制备工艺简单,重现性良好,为共递送载体的开发和应用奠定了理论基础,为肝癌的治疗提供了新的方向。