研究背景与目的急性肢体缺血(acute limb ischemia,ALI)是由动脉栓子、动脉血栓形成或者动脉损伤导致的肢体远端动脉血流突然中断,是血管外科最常见的动脉性疾病之一。近年来,对于该病的诊断和治疗较以往都有了显著地进步,但是其仍然导致较高的截肢率和病死率。但是肢体血运恢复后,常导致肢体缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,IR)损伤,引起肌肉组织和血管组织损伤,以及远隔器官如心、肺、肾、肠道等器官等组织的炎性损伤等,严重者可导致代谢性酸中毒,高钾血症,急性肾功能衰竭,多器官功能障碍综合征,甚至造成病人死亡。缺血刺激及缺血后再灌注均可引发炎症因子介导的炎症瀑式反应,是导致缺血性损伤以及再灌注损伤的重要原因。在急性肢体缺血/再灌注过程中,血管组织发生的炎症反应,常会引起包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素(interleukin,IL)在内的多种炎症因子的合成与分泌,刺激细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)、血管细胞粘附分子(Vascular celladhesion molecule,VCAM)表达上调,趋化聚集白细胞,对血管内皮细胞和血管平滑肌细胞造成炎性损伤。我们认为减轻甚至消除血管组织本身的炎症反应可以起到保护血管功能的作用,有利于减轻肢体缺血/再灌注后造成的炎性损伤。高迁移率族蛋白 B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)是一种高度保守的DNA结合非组蛋白,广泛存在于真核生物的细胞核内,其在核内可以维持核小体结构、稳定染色质、调节基因转录、参与DNA重组以及修饰类固醇激素受体。研究发现,HMGB1释放到细胞外时作为炎症因子广泛参与了缺血/再灌注损伤、组织损伤后修复、动脉粥样硬化、炎症反应等病理生理过程。HMGB1作为早期炎症因子引发的炎症瀑式反应可导致缺血/再灌注损伤,其可以上调ICAM、VCAM的表达,刺激巨噬细胞、单核细胞等产生TNF-α、ILs,促进白细胞粘附和血小板聚集,进一步趋化巨噬细胞、平滑肌细胞迁移等。研究发现,HMGB1在心、脑、肺、肝、肾、肠道和骨骼肌组织的缺血/再灌注过程中均有强阳性表达,而且以HMGB1为靶点的治疗措施可明显减轻实质脏器和肌肉组织的再灌注损伤。我们将在本研究中检测人急性肢体缺血再灌注损伤血浆中HMGB1的表达,并检测大鼠模型中股动脉组织及肝、肺组织中HMGB1的表达,观察其在缺血再灌注损伤炎症反应中的作用。HMGB1在胞外发挥作用主要是通过与其受体结合来实现的。目前胞外HMGB1的受体主要有晚期糖蛋白终末产物受体(receptor for advanced glycation end products,RAGE)及 Toll 样受体 2/4(Toll-like receptors 2/4,TLR 2/4)。研究发现胞外的HMGB1与相应受体结合后发挥其生物学作用,与受体结合后可以启动炎性反应。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一种病原体功能识别的跨膜受体,可以识别细菌,病毒以及其它一些病原体。目前已知,TLRs在免疫应答和介导细胞内的炎症反应中有着很重要的作用。TLRs被激活后,通过各自的细胞内信号通路,激活下游转录因子,可以使宿主细胞产生大量的炎症因子。TLRs的传导通路一般分为二条,分别是MyD88和Trif依赖性通路。TLR2仅通过MyD88通路下传信号,而TLR4有以上两条传递信号通路。这两条通路通过细胞内的激酶激活转录因子,比如核因子NF-κB,产生促炎因子,比如TNF、IL和干扰素(Interferon,IFN)。TLR4介导的信号通路包括髓样细胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依赖性途径和MyD88非依赖性途径。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路主要包含细胞外信号调节激酶 1 和 2(extracellular signal-regulated protein kinase 1 and 2,ERK1/2)、c-Jun N 端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和 p38 蛋白激酶通路。MAPK作为TLR4下游信号分子介导MyD88依赖性途径,最终活化核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κ B),诱导一系列特定基因表达,引起炎性细胞因子释放进而造成再灌注后细胞损伤。但是HMGB1在急性肢体缺血/再灌注过程中特别是该过程血管组织损伤中与哪个或哪些受体相结合,激活了怎样的下游通路尚不明确。在本研究中,我们将检测HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κ B-TNF α、IL-6信号通路蛋白及炎症因子在缺血再灌注损伤股动脉中的表达,并分别应用HMGB1抑制剂Ethylpyruvate和TLR4抑制剂TAK-242预处理,观察通路蛋白及炎症因子的变化,研究其在肢体缺血再灌注动脉损伤中的作用。本研究将通过检测人血浆中HMGB1及炎症因子的表达,研究其在急性下肢缺血再灌注损伤中的作用;构建急性肢体缺血/再灌注大鼠模型,对肢体血管组织炎症反应过程以及HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κ B信号通路在此过程中具体的作用机制进行了深入的研究,研究结果可以从炎症因子的角度阐释急性缺血/再灌注过程中血管组织的病理改变,并将为急性肢体缺血再灌注损伤的临床治疗提供理论依据和新的线索。研究内容第一部分:HMGB1在急性下肢缺血再灌注损伤血浆中的表达及意义第二部分:HMGB1及TLR4-MyD88-NF-κ B信号通路在肢体缺血再灌注过程动脉损伤中的作用及机制研究研究方法第一部分1.选择2017年1月至2017年12月因急性肢体缺血于发病6小时内,在我院行股动脉切开取栓治疗的患者21例为手术组(均为急性动脉栓塞),另选择下肢造影正常者10例为健康对照组。两组分别于术前10分钟、术后24小时、术后48小时留取静脉血5ml,离心后置于-80℃冰箱保存。2.Elisa 检测血清中 HMGB1、IL-6、TNF-a 水平。第二部分1.动物模型的建立和分组:将Wistar雄性大鼠分为正常组、假手术组、缺血再灌注组。利用血管夹阻断股动脉结合橡皮筋环扎后肢根部建立急性肢体缺血模型,缺血6小时后取出血管夹和止血带,开放血流12h建立缺血再灌注模型。2.收集标本:再灌注12h后处死大鼠,收集股动脉、下腔静脉血备用。3.用HE染色法观察血管组织形态及结构的病理改变。4.免疫组织化学染色法观察股动脉组织中HMGB1、TNF-a、IL-6的表达情况。5.用Western blot方法检测动脉血管中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κ B蛋白的表达水平。6.用SyberGreen实时荧光定量PCR方法检测动脉血管中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κ BmRNA的表达水平。研究结果第一部分1.两组患者年龄(岁)、性别、吸烟率(%)、高血压患病率(%)、糖尿病患病率(%)、血脂(mmol/L)、肌酐(μmol/L)、谷丙转氨酶(mmol/L)水平差异无统计学意义(P>0.05)。2.ALI手术组与健康对照组相比,各时间点血浆HMGB1水平均高于相应时间点健康对照组(P<0.01)。ALI手术组与健康对照组,两组血浆HMGB1水平于术后24小时较术前即刻均出现了明显增高(P<0.01),且两组血浆HMGB1水平于术后48小时较术后24小时出现了明显下降(P<0.01),而两组血浆HMGB1水平于术后48小时较术前即刻差异无统计学意义(P>0.05)。3.ALI手术组与健康对照组相比,各时间点血浆IL-6水平均高于相应时间点健康对照组(P<0.01)。ALI手术组与健康对照组,两组血浆IL-6水平于术后24小时较术前即刻出现了明显增高(P<0.01),但两组血浆IL-6水平于术后48小时较术后24小时差异无统计学意义(P>0.05),且两组血浆IL-6水平于术后48小时较术前即刻仍明显升高(P<0.01)。4.ALI手术组与健康对照组相比,各时间点血浆TNF-α水平均高于相应时间点健康对照组(P<0.01)。ALI手术组与健康对照组,两组血浆TNF-α水平于术后24小时较术前即刻出现了明显增高(P<0.01),且两组血浆TNF-α水平于术后48小时较术后24小时出现了明显下降(P<0.01),但是两组血浆TNF-α水平于术后48小时较术前即刻仍明显升高(P<0.01)。5.ALI手术组与健康对照组,两组对应时间点血浆HMGB1水平与IL-6水平相关无统计学意义(均P>0.05),而两组对应时间点血浆HMGB1水平与TNF-α水平呈正相关(P<0.01)。第二部分1.成功建立大鼠后肢急性缺血再灌注模型;与正常组和假手术组相比,急性肢体缺血再灌注大鼠模型组血浆中HMGB1表达明显升高(P<0.01),大鼠股动脉管壁中 HMGB1、IL-6、TNF-α 表达明显升高;血管组织中 HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κ B表达在缺血再灌注组较假手术组明显升高(P<0.01),在EP预处理组,上述指标较缺血再灌注组均有明显下降(P<0.01),但比假手术组仍明显升高(P<0.05);而在TAK-242预处理后,HMGB1较缺血再灌注组无明显变化,TLR4、MyD88、NF-κ B较缺血再灌注组均有不同程度的下降(P<0.05),TLR4、MyD88下降明显(P<0.01),NF-κ B下降幅度较小(P<0.05);与EP+IS组相比,TAK-242+IS组HMGB1表达量较高(P<0.05),TLR4无明显差别(P>0.05),MyD88表达略高,但无意义(P>0.05),NF-KB表达升高(P<0.05)。2.假手术组可见内皮细胞和平滑肌细胞大致正常,弹力纤维层结构正常;缺血再灌注组可见血管壁胶原纤维的降解,弹力层的波浪状结构被破坏,部分内皮细胞消失,平滑肌细胞数量减少,并可见炎性细胞浸润。EP+缺血再灌注组可见血管壁胶原纤维部分降解,弹力层的波浪状结构部分被破坏,部分内皮细胞消失,平滑肌细胞数量减少,并可见炎性细胞浸润减少;TAK-242+缺血再灌注组基本同EP+缺血再灌注组。3.免疫组化显示:缺血再灌注组HMGB1、TNF-a、IL-6的表达明显升高(P<0.01),广泛存在于内皮细胞和平滑肌细胞,但是其表达强度各不相同。4.Western blot结果显示:实验组血管组织中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB的表达明显升高(P<0.01);HMGB1在EP+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),TAK-242+缺血再灌注组较缺血再灌注组无明显变化(P>0.05),但较EP+缺血再灌注组高(P<0.05)。TLR4在EP+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),TAK-242+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),TAK-242+缺血再灌注组较EP+缺血再灌注组无明显变化(P>0.05)。MyD88在在EP+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),TAK-242+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),但较EP+缺血再灌注组略高,但无统计学意义(P>0.05)。NF-κB在EP+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.01),TAK-242+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),EP+缺血再灌注组较TAK-242+缺血再灌注组低(P<0.05)。5.SyberGreen实时荧光定量PCR结果:缺血再灌注组血管壁组织中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-a、IL-6mRNA 水平明显升高(P<0.01)。HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 的表达水平同 Western一致。TNF-a、IL-6mRNA水平在EP+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.01),TAK-242+缺血再灌注组较缺血再灌注组明显降低(P<0.05),EP+缺血再灌注组较TAK-242+缺血再灌注组低(P<0.05)结论1.急性肢体缺血后再灌注可导致全身组织发生炎症反应,血浆中高表达HMGB1,是炎症细胞因子的重要来源。HMGB1发挥作用可能是通过调节IL-6、TNF-a实现的,但其具体作用机制不明。2.应用血管夹及橡皮筋结合可成功构建急性肢体缺血再灌注大鼠模型,可导致动脉血管组织及全身发生炎症反应。急性肢体缺血再灌注动脉血管组织及血浆中大量表达HMGB1,是炎症细胞因子的重要来源。其作用可能是通过上调相关炎症因子的表达来实现的。3.HMGB1在缺血再灌注动脉损伤中的作用是通过HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κ B信号通路实现的,但不完全是依靠HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB信号通路实现的。4.HMGB1抑制剂Ethyl pyruvate和TLR4抑制剂TAK-242可减轻缺血再灌注过程动脉损伤的炎症反应,减轻组织损伤,为急性肢体缺血再灌注损伤的临床治疗提供理论依据。