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葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,Gox)作为一种新型饲用酶制剂,在畜禽生产上通过改善肠道环境、预防肠道感染和腹泻,从而提高饲粮消化利用率,促进其生长。优良的饲用Gox应具有良好的热稳定性和酸稳定性。本研究以实验室前期获得的Gox酶突变体GoxM4为研究材料,利用计算机辅助设计进行分子改良研究,获得热稳定性和酸稳定性显著提高的突变体,并探究Gox的热稳定性和酸稳定性机理。采用计算机辅助的理性设计对GoxM4继续进行热稳定性改良研究。通过糖基化修饰、辅基FAD结合能优化、疏水作用力引入和折叠自由能优化等四种策略进行迭代突变,获得了累积5个氨基酸突变位点的突变体GoxM8(T31V/Q88R/S94A/T274F/Y278T)。GoxM8的热稳定性显著提高,在80°C下处理2 min后的剩余酶活由GoxM4的40%提高到了80%。基于酶恒定剩余酶活Amin与温度之间的负相关性计算其Tm值,GoxM8较GoxM4提高了9.5○C。Gox M8的催化效率(kcat/Km值)较GoxM4提高了6.8%,分别为28.3 mM-1s-1和26.5 m M-1s-1。利用分子动力学模拟技术对突变体热稳定性提高的分子机理进行了分析,引入新的氨基酸位点后,通过消除辅基FAD的空间位阻、增强疏水核心间的作用力、增强局部静电相互作用,提高了GoxM8结构的稳定性。研究结果实现了在不损失酶活的前提下显著提高Gox M4热稳定性的研究目标,满足了饲料工业的应用。为提高Gox在酸性环境下的稳定性,对GoxM8进行了酸稳定性改良研究。基于蛋白质中氢键的数目会影响氨基酸的pKa值理论结合多序列分析策略,确定了可能与酸稳定性相关的三个位点Ala14、Gln241和Arg499。分别构建单点突变体(A14E、Q241E和R499E)和组合突变体A14E/R499E和A14E/Q241E/R499E进行异源表达和性质测定。五个突变体的最适pH均为5.0,较Go xM8降低了1个单位;在pH 3.0下处理1 h后,GoxM8的剩余酶活为69%,突变体A14E、Q241E的剩余酶活分别为70%、74%,R499E、A14E/R499E和A14E/Q241E/R499E的剩余酶活性均为100%,酸稳定性都有所改善。单点突变体A14E和R499E的比活较Gox M8分别提高了21%和33%,组合突变体A14E/R499E和A14E/Q241E/R499E的比活与GoxM8一致。通过结构分析发现,第14位和241位的氨基酸突变后,改变了局部氢键网络,影响了催化残基His514的pKa值;当241位的Gln突变为Glu后,可消除α-螺旋偶极子产生的影响,从而稳定蛋白质结构。研究结果实现了在不损失酶活的前提下提高Gox的酸稳定性的研究目标。本论文以葡萄糖氧化酶突变体GoxM4为研究对象,基于计算机辅助的理性设计策略,在不影响酶活的前提下显著提高了其热稳定性,解决了葡萄糖氧化酶在生产应用过程中不耐热的问题;首次开展了葡萄糖氧化酶的酸稳定性改良研究,基于酶的嗜酸性机理结合多序列分析的策略,在不影响酶活的前提下有效改善了其酸稳定性,为同类酶的酸稳定性改造提供了理论支撑。