月华丸(胶囊)含药血清对耐多药结核分枝杆菌感染细胞自噬影响的实验研究

来源 :湖南中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:fang200710081202fang
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目的:研究月华丸(胶囊)对耐多药结核分枝杆菌感染细胞自噬的影响,探讨和揭示月华丸(胶囊)抗结核、尤其是抗耐多药难治性结核免疫作用的效应及其机制。方法:(1)月华丸(胶囊)含药血清的制备。以人与大鼠间按体表面积换算等效剂量的3倍剂量,给大鼠每日灌胃1次,连续灌胃7天,经腹主动脉取血制备含药血清。(2)质量控制。HPLC法对月华丸(胶囊)主要药物地黄、麦冬和百部的血中移行有效成分进行定性定量测定。(3)含药血清有效浓度测定。CCK-8法检测月华丸(胶囊)含药血清对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)活性的影响,选取月华丸(胶囊)含药血清有效作用浓度。(4)细胞感染。1μg 1×107·mL-1的耐多药结核分枝杆菌菌悬液感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)。(5)自噬观察及检测。以月华丸(胶囊)含药血清作用于耐多药结核分枝杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),观察对细胞感染后自噬的影响。实验分组方法:除正常空白组为未感染的细胞之外,将耐多药结核分枝杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)分为4组,总共为5组,分别为:(1)阴性对照组;(2)月华丸(胶囊)含药血清组;(3)月华丸(胶囊)含药血清+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组;(4)阳性对照雷帕霉素组;(5)正常空白组。指标检测:(1)自噬体。透视电镜下观察月华丸(胶囊)含药血清对耐多药结核分枝杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)自噬体出现和形成的影响。(2)自噬关键蛋白。Western blot检测自噬形成关键蛋白LC3的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化。结果:(1)制取12.05 g·kg-1·d灌胃药量月华丸(胶囊)含药血清。(2)HPLC法检测月华丸(胶囊)含药血清中的地黄苷A、麦冬皂苷D和原百部碱的含量分别为0.104、0.098、0.141mg·g-1。(2)月华丸(胶囊)含药血清对小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)活力作用表明,10%含药血清浓度时细胞增殖效果最佳,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)(1)透射电镜显示,阴性对照组、空白对照组和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组中均未见自噬小体;10%月华丸(胶囊)含药血清组及阳性对照雷帕霉素组可见自噬小体的出现和形成。(2)Western blot检测显示,与其他各组比较,10%月华丸(胶囊)含药血清组RAW264.7巨噬细胞中LC3Ⅱ的蛋白表达水平明显增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例也明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)月华丸(胶囊)含药血清中含有主要药物有效成分的移行,可进行质量控制。(2)月华丸(胶囊)含药血清能促进小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)的增殖,对其活力有促进作用。(3)月华丸(胶囊)含药血清对耐多药结核分枝杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)自噬有促进作用,通过诱导巨噬细胞自噬杀灭结核分枝杆菌可能是月华丸(胶囊)抗结核、抗耐多药结核的机制之一。
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