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该文旨在为通过体细胞克隆途径生产转基因绵羊和山羊建立一套实用的核移植技术程序.为此采用成纤维细胞作为供体细胞对体细胞核移植各个关键步骤包括:卵母细胞成熟、去核、融合和激活的条件进行摸索.此外,对供体细胞周期同步化的方法和利用同源重组打靶栽体生产转基因羊的技术进行了初步探索.选择绵羊和山羊的成年和胎儿成纤维细胞建系并进行Sry PCR性别鉴定.培养后期添加早期培养细胞的条件培养液,有利于保持体外培养至20代的细胞染色体数正确,不发生显著变化,因此20代内细胞可以用于基因转染、筛选以及核移植.绵羊卵母细胞成熟时间和去核时间以24小时为宜;成纤维细胞与卵母细胞适宜电融合条件为:5V交流电预处理,脉冲场强2.0v/cm,脉冲时程20-30μsec,脉冲次数两次;重构胚采用离子霉素激活的卵裂率显著高于乙醇和A23187处理组.山羊卵母细胞成熟率在成熟培养20-28小时内变化不显著;去核时间24-26小时为宜;成纤维细胞与卵母细胞的融合场强范围适宜在2.0-2.6kv/cm;离子霉素+1.9mM6-DMAP处理组原核形成率显著高于离子霉素+10μg/ml CHX处理组以及添加2μg/ml CD的CHX激活组.山羊卵母细胞成熟28小时激活,胚胎的桑椹胚和囊胚形成率最高.该文还对体细胞克隆生产定点整合转基因胚胎进行了初步研究.实验中采用pLoxp正负筛选载体构建的mAAT同源重组载体(mAAT)和Myostatin同源敲除型载体(Myo),以及基于pEGFP载体构建的GFP同源重组型载体,转染山羊和绵羊的成年和胎儿成纤维细胞,经G418和GANC筛选的阳性细胞作为供体进行核移植.随机型GFP和同源型GFP供体细胞其融合率、卵裂率和发育至桑椹和囊胚的百分率在不同细胞系有显著差异;GFP、Myo和mAAT体细胞重构胚的融合率和卵裂率无显著差异(P>0.05);绵羊mAAT组桑囊率显著低于GFP和Myo组;山羊GFP与Myo细胞之间的核移植效率差异不显著.早期克隆胚胎能够表达外源基因,说明在体细胞中整合同源重组型表达载体实现基因在胚胎中定点整合是可行的.