近年来,砷相关疾病和砷剂在临床上的应用,引起国内外学者广泛和深入的研究;与之相应,维A酸类药物的基础研究和临床应用也推动了相关学科的长足进步。在血液病学方面,维A酸对某些白血病的治疗取得良好疗效,砷剂对维A酸治疗抵抗患者表现较好的缓解效应,研究表明二者通过各自的治疗机制在同一患者具有协同作用。在皮肤病学方面,含砷制剂作为治疗银屑病的古老药物至今仍是一些中成药的重要组分,但同时由于砷的长期过量摄取在皮肤的蓄积可引起砷角化病,甚至肿瘤的发生;而维A酸类药物作为当前治疗银屑病的最主要药物,对砷相关皮肤病具有良好治疗作用,我们推测二者对其靶器官-皮肤,或者说对角质形成细胞的增殖、分化过程,是否通过不同的信号传导途径发挥作用?相互之间是否存在一定的联系?这也是我们研究的目的之一。通过饮水、燃煤、药物、职业等因素长期接触砷,可引起皮肤、肺和膀胱等组织器官的肿瘤发生。尤其在皮肤的蓄积,出现色素沉着、皮肤角化、基底细胞癌、鳞状细胞癌等相关皮肤病。砷的致癌是一个长期和复杂的过程,目前没有良好的动物模型,而砷刺激体外培养的角质形成细胞(KC)是一个相对理想的模型。近来基因芯片分析显示砷处理靶细胞后发生改变的基因多与过氧化作用、增殖和分化相关;与细胞生长调节相关的基因表达中,表皮生长因子受体(EGFR)细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)途径是非常重要的。Cooper的研究显示在角质形成细胞砷能刺激p38和ERK的活化,且呈时间和浓度依赖性,其中ERK的活化依赖EGFR,部分依赖Src激酶的活性,而p38活化不依赖EGFR和Src。砷刺激丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号还能导致激活蛋白-1(AP-1)调节基质金属蛋白酶9(MMP-9)的生成。我们过去研究显示:在一定浓度范围,砷剂能刺激角质形成细胞增殖,表现为DNA合成增加,可能与ERK活化、E2F1表达升高有关。本文中我们在细胞周期调控因子方面作了进一步的探讨,结果显示虽然三氧化二砷没有明显影响角质形成细胞CDK2的表达,但不同程度促进了CDK4、cyclinE的表达。为进一步全面了解对KC的影响,我们采用基因表达谱芯片技术,对长期低浓度砷处理KC的基因表达谱进行了研究,结果显示了176条表达差异基因,其中120条基因下调表达,56条基因上调表达,差异表达基因多为涉及信号传导、DNA的结合及转录因子、细胞周期蛋白和肿瘤相关基因。目前越来越多的证据表明砷相关皮肤病患者可伴有免疫功能方面的异常,Soto-Pena GA等研究砷暴露对机体免疫功能的影响,收集从饮水中摄入过量砷的儿童的外周血单个核细胞(PBMC),对其淋巴细胞亚群、PBMC丝裂原增殖反应和尿砷水平进行检测,结果尿砷水平的升高和植物血凝素(PHA)刺激增殖反应的降低(P=0.005)、CD4亚群比例和CD4/CD8以及IL-2分泌水平相关。我们通过荧光定量PCR发现用砷预处理明显抑制PHA刺激淋巴细胞的Janus激酶3(JAK3)表达,从而抑制淋巴细胞的增殖活化及免疫功能可能是砷相关皮肤病的机制之一。维A酸广泛用于治疗各种角化异常性皮肤病、光老化性皮肤病及多种皮肤肿瘤,被称为皮肤病治疗学上的“第三个里程碑”,报告显示维A酸类药物治疗砷相关皮肤病取得较好疗效,具体机制不清。我们通过砷剂处理促进KC增殖,进而研究芳维A酸氨丁三醇及依曲替酸对KC增殖、细胞周期的影响,探讨了维A酸治疗砷相关皮肤病的可能机制。本课题紧密结合临床,对砷、砷相关皮肤病、维A酸、KC之间的联系进行了文献综述,通过体外培养KC、人外周血淋巴细胞,应用蛋白印迹、荧光定量PCR、基因芯片等技术手段,对砷相关皮肤病的发病机制和维A酸的拮抗效应进行了一定探索。第一部分砷剂对角质形成细胞CDK2、CDK4和cyclinE蛋白表达的影响(一)目的:研究砷剂对角质形成细胞细胞周期调控因子蛋白表达的影响。(二)方法:以体外培养的角质形成细胞株为对象,一定浓度砷剂处理细胞后,用免疫印迹方法研究HaCaT细胞周期蛋白依赖激酶2(CDK2)、周期蛋白依赖激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白E(cyclinE)的表达情况及砷剂对之表达的影响。(三)结果:未受到砷剂处理的对照组细胞稳定表达CDK2、CDK4和cyclinE,当1nmol/L三氧化二砷处理24h后,HaCaT细胞表达CDK4、cyclinE水平升高,但CDK2的表达水平未显示明显变化。(四)结论:一定浓度砷剂可刺激角质细胞增殖,可能与其升高细胞周期调控因子CDK4、cyclinE蛋白表达,导致S期细胞比例升高有关,为其致癌机制提供一定的理论依据。第二部分砷通过下调JAK3表达抑制淋巴细胞增殖(一)目的研究砷剂对淋巴细胞增殖和JAK3表达的影响。(二)方法以分离培养的外周血淋巴细胞为对象,不同浓度砷剂处理后,采用3H-TdR方法检测淋巴细胞增殖;并进一步探讨其影响淋巴细胞增殖的机制,用Realtime-PCR方法研究细胞JAK3表达情况。(三)结果0.01、0.1、1μM砷剂组,摄入的同位素活性不同程度降低,其中0.01μM砷剂组同对照组相比(P>0.05),差异无统计学意义,而0.1、1μM砷剂组和对照组相比(P<0.05),差异均有统计学意义;Real-time PCR结果显示:抑制增殖的淋巴细胞组,JAK3 mRNA水平显示下调。(四)结论一定浓度的砷剂可下调JAK3的表达,抑制淋巴细胞增殖,从而影响机体的免疫功能,可能是砷剂治疗或砷相关疾病发生的病理机制之一。第三部分长期低浓度砷诱导角质形成细胞的基因芯片研究(一)目的采用基因芯片技术研究长期低浓度砷处理角质形成细胞的基因表达谱变化。(二)方法体外培养角质形成细胞,并用低浓度(0.05μmol/L)三氧化二砷孵育30d,提取砷处理前后的角质形成细胞总RNA,反转录成cDNA。分别用Cy3和Cy5两种不同的荧光染料标记探针,与表达谱芯片进行杂交,通过扫描寻找差异表达基因。(三)结果筛选出176条表达差异基因,其中120条基因下调表达,56条基因上调表达。差异基因主要编码细胞信号传递蛋白、DNA结合及转录因子、细胞周期蛋白以及肿瘤相关基因等。(四)结论低浓度长期砷处理角质形成细胞引起多种基因的表达改变,为研究砷的致癌机制提供了依据。第四部分维A酸对砷刺激角质形成细胞增殖的拮抗作用(一)目的研究维A酸药物对三价砷刺激角质形成细胞增殖的拮抗作用及其机制。(二)方法以体外培养的角质形成细胞为对象,低浓度三价砷预处理细胞刺激增殖,并用3H-TdR掺入法分析不同维A酸药物对细胞增殖的拮抗效应,进一步用流式细胞仪检测细胞周期变化。(三)结果一定浓度三价砷可刺激角质形成细胞增殖,加入不同浓度芳维A酸氨丁三醇、依曲替酸处理24小时,显示0.01-1μM维A酸可不同程度拮抗砷剂的刺激增殖效应,芳维A酸氨丁三醇作用强于依曲替酸。流式细胞仪检测细胞周期分布变化,显示维A酸处理后S期细胞比例降低,G0-G1期细胞比例升高。(四)结论低浓度的三价砷可刺激角质形成细胞增殖,而维A酸可拮抗砷剂的刺激增殖作用,使S期细胞比例降低,可能是维A酸类药物治疗砷相关皮肤病的机制之一。