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实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是人类自身免疫性疾病多发性硬化症(MS)的动物模型，以中枢神经系统的炎症、脱髓鞘和轴突损伤为特征[1]。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)为少突胶质细胞表面外层的膜蛋白，具有很强的抗原性，是引起脱髓鞘的主要免疫靶点[2]。其中35-55位氨基酸组成的抗原肽MOG35-55可在C57BL/6小鼠体内诱导MOG35-55/I-Ab特异性自身反应性CD4-T细胞异常活化，诱发EAE[3]。抗原肽/MHC II复合物(pMHC)二聚体是由MHC II类分子共价结合一个特异性抗原肽并与免疫球蛋白IgG Fc段重组而成；通过IgGFc段的链问二硫键作用可形成MHC II类分子二聚体，能与TCR高亲和力结合，从而可用于检测或调节抗原特异性T细胞的研究[4，5]。MHC II类分子是由链、β链非共价结合而成的异二聚体，由于其结构的复杂性，体外表达存在较大的困能。本研究拟利用杆状病毒双表达系统，通过抗原肽MOG35-55与I-Ab链N端共价连接促进真核表达的I-Ab正确折叠，并引入亮氨酸拉链结构及IgG的F段构建MOG-I-Ab/Fc二聚体，以期获得正确构象的MOG-I-Ab/Fc二聚体，为研究MOG35-55诱导EAE的机制与干预手段提供物质基础。本研究的主要内容及结果如下：
⑴pFastBacTM Dual+[MOG35.55-I-Ab/Fc]真核表达载体的构建利用相应的引物通过RT-PCR获得所有目的片段cDNA；通过重组PCR技术获得共价连接抗原肽MOG35-55的融合基因；利用基因重组技术，将I-Ab-Fos与IgGFcγ2b顺序连入双表达载体pFastBacTM Dual的Ph启动子下游，将MOG35-55--Jun连入PFastBacTM Dual的P10启动子下游，获得pFastBacTM Dual+[MOG35-55-I-Ab/Fc]重组质粒；经测序比对显示无有义突变，显示真核表达载体构建成功。
⑵MOG-Ab/Fc融合蛋白的表达及鉴定按照bac-to-bac昆虫表达系统操作说明，将pFastBacTM Dual+[MOG-I-Ab/Fc]重组质粒转化大肠杆菌DH10TM E coli.，获得重组Bacmid杆粒；利用Cellfection2000脂质体将该重组杆粒转染sf9昆虫细胞；重组杆粒经表达装配形成含MOG-I-Ab/Fc基因的重组杆状病毒：收集重组杆状病毒，进一步感染sf9细胞；收集感染后细胞上清，该上清即含有MOG-I-Ab/Fc二聚体融合蛋白；利用SPA柱对融合蛋白进行亲和层析浓缩纯化，经ELISA、SDS-PAGE、Western blot及流式细胞术检测，显示重组蛋白能在昆虫细胞sf9中正确表达且具有生物学构象。