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目的肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)是由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)产生的一种重要的溶细胞毒素。近年来研究证实小剂量PLY可诱导宿主细胞凋亡,但其机制尚不清楚。本研究通过体外表达纯化PLY重组蛋白并选用人脐静脉内皮细胞(The Human umbilical vein endothelial cell line, HUVEC)作为体外细胞模型,观察PLY重组蛋白是否能诱导HUVEC凋亡,且该过程是否有caspase途径和MAPK途径的参与。方法1.在E.coli BL21中表达融合6个组氨酸标签的PLY重组蛋白,采用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白,通过SDS-PAGE和溶血试验鉴定其分子量和溶血活性。2.观察PLY对HUVEC的增殖抑制和诱导凋亡作用:采用MTT法检测HUVEC的增殖情况,采用Annexin V/PI双标记染色法检测凋亡率,并提取细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳观察细胞核染色质DNA的断裂。3.采用ELISA检测PLY作用细胞后的caspase-3,8,9的活性变化,采用免疫细胞组化检测细胞ERK1/2、p38MAPK的表达水平,以Western Blot检测经PLY作用后ERK1/2和p38MAPK的总蛋白水平和磷酸化水平变化。结果1.成功构建质粒Ply-pW28并实现了PLY蛋白的可溶性表达,所获重组蛋白纯化后纯度达到95%。溶血实验显示PLY对人红细胞具有极高的溶血活性,并呈明显剂量依赖性(p<0.05),在100ng/ml时溶血率为100%。2. PLY重组蛋白与HUVEC共孵育后,HUVEC的增殖受到了明显的抑制,并呈明显的时间和剂量依赖性,IC50(24h)为1.525μg/ml。PLY处理后HUVEC黏附能力降低,部分细胞皱缩变圆,失去典型“鹅卵石样”形态特点,并呈明显剂量依赖性。Annexin V/PI双标记染色法检测到0.5μg/ml、1μg/ml和2.5μg/ml的PLY与HUVEC共孵育24h后细胞的早期凋亡率分别为8.91%、27.43%、31.50%,与对照组细胞凋亡率为2.67%相比较显著增高(P<0.05)。琼脂糖凝胶电泳可见凋亡细胞DNA的断裂。3. 1μg/ml PLY与HUVEC孵育24h后caspase-3,8,9活性无明显变化。免疫细胞组化结果显示:与对照组相比,PLY处理组ERK1/2表达减弱,而p38MAPK则表达增加。Western Blot结果显示:与对照组相比,PLY处理组的ERK1/2和p-ERK1/2的表达水平均显著下降,而p38MAPK和p-p38MAPK表达水平均增加。结论PLY可抑制HUVEC增殖并诱导其凋亡,该效应至少部分是通过抑制ERK1/2信号途径和激活p38MAPK信号途径而实现的,但该效应并不依赖于caspase-3,8,9的活化。