非洲猪瘟病毒I226R基因功能的研究

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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度传染性传染病。自2018年我国首次报告非洲猪瘟疫情以来,对我国养猪业造成严重危害。非洲猪瘟病毒是一种含囊膜双链DNA病毒,基因组全长170-193 kb的,含有最少160个阅读框,但其中大部分基因功能尚不明确。至今也无成功的商品化疫苗,研究非洲猪瘟未知基因功能,是研制非洲猪瘟疫苗的重中之重。非洲猪瘟病毒基因组中I226R基因功能尚未明确。在已知的非洲猪瘟病毒分离株中也未发现过这个基因的自然缺失,且在I226R的基因附近的DP71L、L7L-L11L、I177L等多个基因被证明与毒力相关。所以为了初步探究非洲猪瘟病毒基因组中I226R基因的功能,开展以下研究内容:1、原核表达非洲猪瘟病毒基因组上I226R基因编码的p I226R蛋白,并制备其多克隆抗体。2、利用单基因片段缺失毒株SY18ΔI226R探究I226R缺失对ASFV体外生物学特性影响,以及利用抗p I226R蛋白多克隆抗体对p I226R蛋白进行亚细胞定位。3、研究SY18ΔI226R较亲本毒株ASFV SY18对猪致病力的差异,推测I226R基因是否为ASFV毒力关键基因。4、若SY18ΔI226R失去致病力,对实验动物进行攻毒,评价其免疫保护效果,研究其作为疫苗候选株的可能性。通过以上研究得到以下结果:1、发现缺失I226R基因片段的SY18ΔI226R在体外巨噬细胞中的增殖速度比亲本毒株慢,但病毒粒子形态及红细胞吸附特性未发生改变。2、通过亚细胞定位观察发现I226R基因表达位置主要位于细胞质的“病毒工厂”中。3、当长白猪分别接种10~4TCID50和10~7TCID50的SY18ΔI226R后至攻毒前的整个观察期内,所有猪均保持健康,未发生死亡。结果说明I226R的缺失导致非洲猪瘟病毒的毒力完全丧失,I226R基因是与非洲猪瘟病毒毒力相关基因。4、在接种SY18ΔI226R单基因缺失毒株后21日后,免疫猪体内产生高水平抗体,以亲本毒株ASFV SY18攻毒后,免疫猪全部存活。说明免疫SY18ΔI226R单基因缺失毒可以使猪在体内产生高水平抗体,并且可以抵抗亲本毒株的攻击。综上所述,本研究首次发现ASFV基因组中I226R基因在细胞质中“病毒工厂”表达。I226R基因缺失使非洲猪瘟病毒增殖能力减弱但不完全影响复制,并且使ASFV SY18毒株在家猪感染中失去毒力,说明I226R基因是非洲猪瘟病毒毒力关键基因。SY18ΔI226R单基因缺失毒株接种后不会使猪发病和死亡,并且使猪在亲本毒株攻击下获得100%保护。以上结果为非洲猪瘟病毒中I226R基因的深入研究提供了重要参考数据,为基因缺失疫苗候选毒株提供新基因参考,并帮助研究人员更全面了解非洲猪瘟病毒基因组,以加快非洲猪瘟疫苗的研发。
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