猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,有PCV1和PCV2两种基因型,PCV1无致病性,PCV2是断奶仔猪多系统衰竭(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)主要病原,也是目前养猪业危害最大的病原之一,对世界养猪业造成严重影响并且产生巨大的经济损失。除PMWS外,PCV2还可引起猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、猪呼吸系统疾病综合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、繁殖障碍(reproductive failure).肉芽肿性肠炎(granulomatous enteritis)、渗出性表皮炎(exudative epidermitis)、坏死性淋巴结炎(necrotizing lymphadenitis)、先天性震颤(Congenital tremor, CT)等圆环病毒病(porcine circovirus disease, PCVD),或称之为圆环病毒相关疾病(porcine circovirus associated disease, PCVAD)。PCV2既可以水平传播,也可以垂直传播,通过粪便、尿液、乳汁、血清和精液等多种方式排毒,还可与其他细菌、病毒及寄生虫等混合感染,防控难度极大。目前,PCV2致病机理仍不明确,也没有针对该病毒的特效药,猪场主要依靠疫苗预防PCVAD的爆发,但是受到多种因素影响,PCV2疫苗的保护效力也经常不尽人意。一氧化氮(NO)作为一种重要的信号分子,具有复杂多样的病理、生理作用,它能抵抗或杀灭多种病原微生物,包括细菌、寄生虫、真菌和蠕虫等,还能抑制多种DNA、RNA病毒复制和感染,而NO对PCV2复制的影响鲜有报道,本研究通过体内外试验证实NO具有抑制PCV2复制的活性,并探寻该抑制效应的潜在机理,旨在揭示PCV2部分致病机制以及为防控PCVAD提供新的思路。1、NO经NF-κB通路抑制PCV2的体外复制本研究为了探讨NO对猪圆环病毒(PCV2)在Dulac细胞上复制的影响。S-亚硝基乙酰青霉胺(SNAP)用作外源性NO供体,同时将结构类似物但是非NO供体乙酰青霉胺(NAP)用作药物对照。SNAP (50、100、200μM)、NAP (200μM)处理细胞6小时后接种PCV2,继续培养72小时,不接种病毒且不用药物处理的细胞设为阴性对照。通过测定细胞培养上清中NO水平、PCV2感染细胞比例、病毒效价和病毒DNA拷贝数,评价NO对PCV2复制的影响；此外,将pNF-KB-luc报告基因转染到Dulac细胞内,通过检测萤光素酶活性来探讨NO影响PCV2复制的机理是否与NF-κB通路有关。结果显示,NO产生量与SNAP的浓度存在剂量依赖性,NO抑制PCV2的复制并呈剂量依赖效应,此外,不论Dulac细胞是否感染PCV2, NO均能显著抑制NF-κB活性且表现出剂量依赖效应。由此可见,外源性NO通过下调NF-κB的活性抑制PCV2的体外复制。2、NO体外抑制PCV2复制的实现形式为NO·本文旨在探讨NO自由基(NO·)对PCV2复制的抑制作用。我们采用两种NO供体：SNP和抗坏血酸(Vc)在培养基中联合产生NO·,而SNP独自产生NO的主要形式为NO+。PCV2感染的Dulac细胞分别用以上两种形式的NO供体处理,结果显示,NO产生量与这两种供体均表现出剂量依赖效应,SNP+Vc处理组病毒效价与PCV2感染对照组比较,差异极显著(P<0.01), PCV2感染细胞的比例和病毒DNA拷贝数也显著低于PCV2感染对照组(P<0.05),而SNP和Vc单独处理细胞均不影响PCV2的复制。由此可见,SNP和Vc联合产生的NO·对PCV2有显著的抑制作用,SNP产生的NO+并没有抗PCV2活性。因此,NO体外抗PCV2活性主要是通过NO·实现的,与NO+无关。3、外源性NO和内源性NO对PCV2体外复制的影响比较本文旨在探讨外源性NO和内源性NO对PCV2在Dualc细胞内复制的影响。为此,我们采用亚硝基谷胱甘肽(nitrosoglutathione, GSNO)作为外源性NO供体,L-精氨酸(L-arginine)提供内源性NO,L-精氨酸代谢产物瓜氨酸(citrulline)用作药物对照,通过测定NO产生动力学、PCV2感染细胞比例、病毒效价和病毒DNA拷贝数比较二者对PCV2复制的影响。结果显示,与对照组比较,GSNO处理组NO水平呈显著增加(P<0.01),72小时达到峰值,NO水平与GSNO呈现剂量依赖性,L-精氨酸和瓜氨酸处理Dulac细胞均不产生NO；药物处理Dulac细胞后,与感染对照组比较,L-精氨酸和瓜氨酸处理组病毒效价、相对感染细胞和病毒DNA拷贝数均无显著变化P>0.05),而GSNO处理组病毒效价显著低于感染对照组(P<0.05), PCV2感染细胞比例和病毒DNA拷贝数也低于感染对照组并且呈极显著差异(P<0.01)。由此可见,由GSNO产生的外源性NO对PCV2复制呈显著抑制效应,而L-精氨酸处理Dualc细胞不能产生内源性NO,因而不能抑制PCV2复制。4、血红蛋白对NO体外抑制PCV2复制的影响GSNO产生的外源性NO对PCV2体外复制的抑制作用已在第三章的研究中得到证实,本研究用GSNO和NO清除剂血红蛋白(Hb)联合处理Dulac细胞,旨在探讨外源性NO被Hb处理后,其抗PCV2活性是否受到影响。结果显示,各处理组NO水平随Hb浓度升高而降低,表现出一定的剂量依赖性,Hb与GSNO联合处理组NO水平均低于GSNO单独处理组；与GSNO单独处理组比较,Hb与GSNO联合处理组的PCV2感染细胞比例、病毒效价和病毒DNA拷贝数均有不同程度升高,且与Hb呈现剂量依赖效应,20μM Hb与GSNO联合处理组各指标与感染对照组无显著差异(P>0.05)。由此可见,Hb可以有效清除GSNO产生的NO, NO体外抑制PCV2复制的作用可以被清除剂Hb阻断,这也是NO体外抗PCV2活性的另一佐证。5、外源性NO抑制PCV2在BALB/c小鼠体内复制本研究采用BALB/c小鼠人工感染PCV2,同时腹腔注射外源性NO供体GSNO,测定小鼠平均日增重、免疫器官指数、组织和血清样品PCV2阳性比例和血清中PCV2DNA拷贝数以及血清中PCV2特异性抗体水平,以此评价NO对BALB/c小鼠感染PCV2的影响。结果显示,与PCV2感染对照组比较,GSNO处理组小鼠平均日增重、免疫脏器指数均有不同程度的升高；组织和血清样品PCV2阳性比例和血清中PCV2DNA拷贝数呈现下降趋势；不论GSNO处理与否,PCV2感染小鼠的血清中几乎检测不到该病毒的特异性抗体(荧光抗体)。由此可见,GSNO释放的外源性NO对PCV2在BALB/c小鼠体内的复制表现出显著的抑制效应,但是未改变小鼠血清中的PCV2抗体水平。