肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceae)可引起多种社区及医院获得性感染,其中尿路感染(UTIs)是临床常见感染性疾病,约有80%的非复杂性UTIs和40%的复杂性UTIs为大肠埃希菌等肠杆菌科细菌感染所致。近年来产超广谱p内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)肠杆菌科细菌发生率不断升高,造成临床可选用的有效抗菌药物减少。磷霉素是一种广谱杀菌剂,对临床常见革兰阳性菌和阴性菌均具有抗菌活性,与其他抗菌药无交叉耐药性,而与多种抗菌药联合应用时呈协同作用。磷霉素在国内常与万古霉素联合治疗甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)等多重耐药菌感染,不良反应低。在国际上,磷霉素用于治疗非复杂性下尿路感染已有40年余,近年研究发现,应用磷霉素治疗各类UTIs仍然高度有效,且细菌耐药率低。2010年美国感染病学会(IDSA)欧洲微生物学和感染病学会(ESCMID)推荐将磷霉素口服用于治疗非复杂性UTIs,磷霉素静脉制剂用于产ESBLs肠杆菌科细菌感染。因为大肠埃希菌产ESBLs发生率高,选用药物有限,国内也将磷霉素作为复杂性尿路感染的治疗药物。1999年美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)制定磷霉素敏感性判定标准：MIC≤64μg/ml敏感,MIC=128μg/ml中介,MIC≥256μg/ml耐药,仅推荐用于尿道分离大肠埃希菌。目前国内外针对非尿道分离大肠埃希菌和其他肠杆菌科细菌的研究亦多应用此标准。2009年12月欧洲抗菌药物敏感试验委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST)推荐以MIC≤32μg/ml为磷霉素敏感性折点,适用于分离自所有部位的肠杆菌科细菌。肠杆菌科细菌对磷霉素也存在耐药现象,耐药机制主要包括药物摄取减少,靶酶位点改变和磷霉素修饰酶产生。本课题根据CLSI的ESBL确证试验结果,收集了复旦大学附属华山医院2008年临床分离的产ESBLs肠杆菌科细菌257株,包括144株大肠埃希菌和113株肺炎克雷伯菌。测定细菌对磷霉素及其他抗菌药物敏感性；通过PCR扩增及序列测定,了解fos基因携带情况及周边序列；对fos基因阴性的磷霉素耐药菌株进行磷霉素转运系统及靶酶相关的耐药机制研究。从而了解产ESBLs细菌对磷霉素的耐药现状及耐药机制,明确fos耐药基因的传播机制,为多重耐药菌的防控及抗菌治疗提供理论基础。本研究包括以下三个部分：第一部分产ESBLs肠杆菌科细菌对磷霉素及其他抗菌药物的敏感性方法与结果：用琼脂稀释法测定磷霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、磺胺甲嗯唑/甲氧苄啶、四环素、氯霉素18种抗菌药物对产ESBLs肠杆菌科细菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitorty Concentration, MIC)。测定磷霉素MIC时琼脂中加入葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G-6-P),浓度为25μg/ml。磷霉素敏感性判断标准采用2013版EUCAST药敏判断标准(MIC≤32μg/ml为敏感折点)。其他抗菌药物根据2010年版CLSI药敏判断标准判定结果。统计大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对各种抗菌药物的敏感率,比较对除磷霉素外的非p内酰胺类抗菌药物不敏感菌株和敏感菌株分别对磷霉素的敏感率。76.4%(110/144)产ESBLs大肠埃希菌和77.9%(88/113)肺炎克雷伯菌对磷霉素敏感,两者间无统计学差异(P=0.778)。如以MIC≤64μg/ml为磷霉素敏感性折点(CLSI尿路分离大肠埃希菌判定标准),产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对磷霉素敏感率分别为82.6%和84.1%。产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松均耐药,对哌拉西林敏感率≤5%,部分菌株对头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南敏感,对亚胺培南、美罗培南敏感率>96%,对头孢西丁敏感率为59%-63%。大肠埃希菌对哌拉西林/他唑巴坦敏感率为83.3%,肺炎克雷伯菌敏感率为46.9%。产ESBLs大肠埃希菌对阿米卡星敏感率为88.9%,而对庆大霉素、环丙沙星、甲氧苄啶/磺胺异(?)唑、四环素、氯霉素敏感率均低于50%。肺炎克雷伯菌除对四环素敏感率为61.0%外,对其他药物敏感率亦低于50%。阿米卡星不敏感大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对磷霉素敏感率分别为31.2%(5/16)和71.6%(48/67)。除阿米卡星、美罗培南和亚胺培南不敏感株外,其他抗菌药物不敏感菌株对磷霉素敏感率均>68%。98.6%(142/144)大肠埃希菌和86.7%(98/113)肺炎克雷伯菌检出CTX-M型ESBLs基因,CTX-M基因分型与磷霉素耐药率无明显关系(CTX-M-1组与CTX-M-9组比较,P值分别为0.882,0.664)。23.0%(26/113)肺炎克雷伯菌检出SHV型ESBLs或SHV合并CTX-M型ESBLs。小结：磷霉素对产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌具有良好抗菌活性,其他抗菌药物耐药株对磷霉素也有较高敏感性。第二部分fos基因相关的肠杆菌科细菌对磷霉素耐药机制背景：产生修饰酶是细菌对磷霉素的主要耐药机制之一,通过对磷霉素分子结构的修饰使磷霉素失活,目前发现的磷霉素修饰酶主要有FosA、FosB、FosC、 FosX及其各亚型。在磷霉素耐药肠杆菌科细菌中发现了fosA、fosA2、fosA3、fosC2基因。fosA基因定位于质粒,最初发现于粘质沙雷菌中,后相继在多种肠杆菌科、假单胞菌属和不动杆菌属细菌中被发现。希腊一项研究发现10%(3/30)磷霉素耐药肠杆菌科细菌携带fosA基因。2009年Wachino等学者在日本产CTX-M的大肠埃希菌中发现两种新型质粒介导磷霉素耐药基因fosA3和fosC2。多项研究显示1.0%-9.0%大肠埃希菌和1.1%肺炎克雷伯菌携带fosA3基因。研究发现fosA3常与blaCTX-M、rmtB基因共同转移。携带fosA3基因的质粒转移很可能会加速磷霉素耐药性播散,同时因其与ESBLs及其他耐药基因之间的密切关系可能造成不同类别抗菌药物耐药性共同传播。本部分研究通过PCR扩增,了解产ESBL肠杆菌科细菌特别是磷霉素耐药菌株中fos基因携带情况；通过fos基因周边DNA序列测定,了解其周边结构。方法与结果：257株产ESBLs肠杆菌科细菌中行PCR检测fosA, fosA2, fosA3, fosC2基因。对磷霉素不敏感菌株同时进行fosB, fosB2, fosC, fos)(基因检测。结果发现,13.2%(19/144)产ESBLs大肠埃希菌和3.5%(4/113)产ESBLs肺炎克雷伯菌携带fosA3基因。fosA3基因阳性菌株均对磷霉素高度耐药。fosA3基因在磷霉素耐药菌中的检出率分别为55.9%(19/34)和16%(4/25),在高度耐药菌株(MIC≥256μg/ml)中的检出率分别为76.0%(19/25)和28.6%(4/14)。有1株肺炎克雷伯菌K117检出fosA基因,其磷霉素MIC为32μg/ml。未检测到fosA2、fosC2、 fosB、fosB2、fosC、fosX日性菌株。23株菌株中fosA3基因全长序列与最初报道的fosA3核苷酸同源性均为100%。1株肺炎克雷伯菌中fosA基因(fosAK117)与在Tn2921中发现的fosA (fosATn2921)有95%同源性,氨基酸序列FosAK117与FosATn292197.9%同源。对其中1株大肠埃希菌fosA3口肺炎克雷伯菌的fosA进行TA克隆,fos A3和fosA基因克隆株均对磷霉素高度耐药(MIC分别为1024μg/ml及≥1024μg/ml)以大肠埃希菌C600或J53为受体菌,对所有磷霉素耐药菌株进行质粒转移接合试验,并对接合子PCR检测ESBLs基因、fos基因,ERIC PCR确证为接合子。23株fosA3日性菌中20株fosA3携带菌株成功接合,其中16株细菌中fosA3基因与CTX-M型ESBLs基因共同转移,12株细菌中fosA3与TEM-1广谱β内酰胺酶基因共同转移。fosA基因阳性肺炎克雷伯菌K117未能接合成功。对5株fosA3接合子行引物步移法DNA测定分析fosA3基因周边序列。5株细菌质粒fosA3上游均为插入序列IS26,与fosA35’端之间长度均为322bp。fosA3下游不完全相同：3株细菌质粒fosA3下游为IS26,与fosA33’端之间长度为536bp或1758bp；2株细菌质粒fosA3下游为IS1294。对其中3株细菌行长序列测序、分析fosA3与ESBLs基因的位置关系,3株细菌质粒中blacrx-M位于fosA3上游,其中2株细菌质粒同时携带4个耐药基因：fosA3, blacTX-M-9,blaTEM-1,rmtB。1株磷霉素耐药但fos基因PCR检测阴性的大肠埃希菌E265,磷霉素的耐药性可通过接合试验转移至大肠埃希菌J53。提取接合子质粒进行酶切克隆、DNA序列测定,发现一个新的fosA基因亚型(暂命名为fosA4),介导大肠埃希菌E265对磷霉素的耐药性。fosA4与)fosATn2921、fosA2、fosA3核苷酸序列有69%-73%的同源性。FosA4氨基酸序列与FosATn2921、FosA2、FosA3同源性为69%～80%,与FosB. FosC、FosX的同源性为14%～31%。对fosA3基因阳性菌株进行MLST分型,发现菌株间的同源性低,19株fosA3阳性大肠埃希菌属于11个ST型,4株fosA3阳性肺炎克雷伯菌属于3个ST型。小结：fosA3为产ESBLs肠杆菌科细菌中最为流行的fos基因类型,并为本研究中大肠埃希菌对磷霉素高度耐药的主要机制。fosA3基因常与ESBLs基因共同转移。在大肠埃希菌中发现了新的质粒介导磷霉素耐药基因亚型fosA4。IS26可能与fosA3转移和传播有关。第三部分转运系统及靶酶相关的肠杆菌科细菌对磷霉素的耐药机制背景：磷霉素靶酶为二磷酸尿嘧啶-乙酰葡糖胺转移酶(MurA),磷霉素通过使其失活,干扰细菌细胞壁肽聚糖合成,从而发挥杀菌作用。MurA突变或超表达可导致细菌耐药。磷霉素通过甘油-3-磷酸转运系统(GlpT)或磷酸己糖转运系统(UhpT)转运进入细胞。前者主要转运甘油-3-磷酸(G-3-P)；后者转运G-6-P,并需G-6-P诱导打开。GlpT功能正常的菌株可在以G-3-P为唯一碳源的M9基本培养基(G-3-P-M9)上生长,GlpT功能障碍的细菌则无法生长。同理,JhpT功能正常的细菌可在G-6-P为唯一碳源的基本培养基(G-6-P-M9)上生长,UhpT功能障碍者无法生长。编码基因glpT和uhpi基因突变可直接导致相应转运体功能障碍,进入细菌的磷霉素水平降低,从而导致细菌对磷霉素敏感性降低。uhpA编码一种转录调节蛋白,可调控UhpT表达。pts1基因和cyaA基因突变可导致胞内cAMP水平下降。低水平的cAMP可以下调GlpT和UhpT表达,介导耐药。方法与结果：对15标fos基因阴性的磷霉素高度耐药菌(包括大肠埃希菌5株,肺炎克雷伯菌10株)进行靶酶murA基因PCR扩增及序列测定。5株大肠埃希菌靶酶MurA氨基酸序列均无突变。1株肺炎克雷伯菌K672的MurA存在Gln7Pro氨基酸突变。4株肺炎克雷伯菌K2103, K2610, K190, K2304的murA基因扩增不成功,其他5株肺炎克雷伯菌靶酶MurA氨基酸序列无突变。将15株fos基因阴性的磷霉素高度耐药菌及标准菌株ATCC25922接种到以甘油-3-磷酸(Glycerol3-phosphate, G-3-P)或G-6-P为单一碳源的M9基本培养基上5株磷霉素耐药大肠埃希菌和1株肺炎克雷伯菌无法在G-3-P-M9和G-6-P-M9上生长,提示这6株细菌同时存在两种转运体系统(GlpT和UhpT)功能障碍。9株fos基因阴性磷霉素耐药肺炎克雷伯菌可在G-6-P-M9上生长,但在G-3-P-M9上未生长,提示这9株细菌UhpT转运系统功能正常,而GlpT系统存在功能障碍。对15株耐药菌和标准菌株转运体相关基因glpT、uhpT、uhpA、pstI、cyaA进行PCR扩增及序列测定。5株磷霉素耐药大肠埃希菌glp基因全序列均扩增失败,内部保守序列引物扩增成功,推测这5株大肠埃希菌glp边缘序列可能存在大段缺失或突变。10株磷霉素耐药肺炎克雷伯菌glp基因全序列及保守序列均扩增失败,推测10株肺炎克雷伯菌中glpT基因整个缺失或突变。glpT整个基因序列或大段序列的缺失或突变可能直接导致GlpT转运系统功能障碍。无法在G-6-P-M9上生长的6株细菌(5株大肠埃希菌和1株肺炎克雷伯菌)UhpT氨基酸序列均无突变,提示UhpT功能障碍可能与UhpT转录或表达水平有关。其余9株细菌可在G-6-P-M9上生长,其中4株细菌UhpT序列无突变,3株细菌UhpT序列存在Ile127Val氨基酸突变,2株肺炎克雷伯菌UhpT全序列未能成功扩增。除2株大肠埃希菌E2393和E2967的UhpA序列测序失败,1株肺炎克雷伯菌K672的UhpA全序列扩增失败外,其他菌株UhpA氨基酸序列未发现突变。5株大肠埃希菌中PstI和CyaA序列存在较多氨基酸位点突变。肺炎克雷伯菌中PstI和CyaA序列多扩增失败或多次扩增浓度较低、测序失败,仅2株肺炎克雷伯菌细菌PstI序列扩增成功,存在Va1229Ile, Asn241Ser突变。UhpA、PstI和CyaA是否可通过影响GlpT或UhpT表达介导耐药尚需进一步研究。小结：fos基因阴性磷霉素高度耐药肠杆菌科细菌均存在磷霉素转运系统功能障碍。磷霉素高度耐药大肠埃希菌均同时存在两种转运系统功能障碍。glpT基因序列缺失为介导产ESBLs肺炎克雷伯菌对磷霉素高度耐药的主要机制。个别肺炎克雷伯菌同时存在靶酶突变,但与磷霉素耐药性有无关系尚需进一步研究。