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研究背景:乳腺癌是女性多发肿瘤之一。目前,全球乳腺癌的发病率和相关死亡率呈上升趋势,其中,肿瘤细胞的扩散和远处转移是造成乳腺癌患者死亡的主要原因,因此,控制肿瘤的转移对于改善乳腺癌患者的预后具有重要的意义。化疗药物的毒副作用以及耐药性的出现严重限制其临床的应用。有研究表明,苹果多酚中的单一成分,如槲皮素、表儿茶素、花青素等具有抑制乳腺癌转移的作用,但是苹果多酚这种混合物与乳腺癌转移关系的文献报道却相对较少,其作用机制还需要进一步明确。目的:探究不同浓度的苹果多酚在体内、外对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和迁移能力的影响,并阐明其可能的作用机制。方法:1.细胞实验:以对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,用0、50、100、200、400、800μg/ml的苹果多酚分别处理24、48、72h后,台盼蓝染色的方法测定细胞的活力;CCK8试剂盒来测定细胞的生长和增殖;划痕实验来观察细胞迁移能力的变化情况;蛋白质印迹法(Western blot)测定蛋白表达水平的变化;实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测相应基因信使RNA(message RNA,m RNA)表达水平的变化。采用脂质体转染的方法,将泛素样含PHD和环指域1(ubiquitinlike with PHD and ring finger domain 1,UHRF1)、空质粒(PC)转染乳腺癌细胞MDA-MB-231,筛选稳定转染细胞株(MDA-MB-231/UHRF1和MDA-MB-231/PC)。细胞给予0、50、100、200、400、800μg/ml的苹果多酚处理72h,进行台盼蓝染色实验、CCK8实验、划痕实验、Western blot实验和q RT-PCR实验,探讨UHRF1在苹果多酚调节乳腺癌细胞增殖和迁移过程中的作用。2.动物实验:对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231原位接种4周龄大的裸鼠,每只动物接种6×106个细胞,待肿瘤长至50mm3后,将裸鼠随机分为对照组、苹果多酚低剂量干预组和苹果多酚高剂量干预组,其中,高剂量组为250mg/100g.bw/d的苹果多酚进行灌胃,低剂量组为50mg/100g.bw/d,对照组灌胃相同体积的无菌水,干预8周,记录动物体重和肿瘤体积。实验结束后,采用免疫组化的方法,分析肿瘤组织中UHRF1及肿瘤血管生成指标CD34的表达水平。结果:1.苹果多酚体外对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、迁移的影响及其作用机制台盼蓝实验结果表明:在0~800μg/ml的浓度范围内,苹果多酚对细胞活力的抑制作用与其浓度呈正相关,且各浓度之间的差异具有统计意义;相同浓度的苹果多酚对细胞活力的抑制作用,不同作用时间的差异无统计意义。CCK8的实验结果表明:苹果多酚对细胞的抑制作用与苹果多酚的浓度、作用时间呈正相关。800μg/ml的苹果多酚作用24h,其对细胞增殖能力的抑制率为37%,与对照组相比,差异有统计意义(P<0.05);与作用24h相比,800μg/ml的苹果多酚作用48h、72h后,细胞增殖抑制率分别增大到78%和84%,差异具有统计学意义(P<0.05)。划痕试验结果表明:苹果多酚浓度大于200μg/ml即可明显抑制细胞的迁移,且抑制细胞迁移的能力与苹果多酚的浓度和干预时间呈正相关,不同干预浓度和干预时间之间的差异,与对照组相比有统计学意义。当苹果多酚浓度为400μg/ml时,细胞24h的迁移率只有33%,而800μg/ml的苹果多酚处理后细胞的迁移率仅为16%,该差异具有统计学意义(P<0.05)。当苹果多酚浓度为400μg/ml时,细胞24h的迁移率只有33%,而800μg/ml的苹果多酚处理后细胞的迁移率仅为16%,该差异具有统计学意义(W<0.05)。Western blot结果表明:苹果多酚通过抑制AMPK的相关蛋白激酶5(AMP-activated protein kinase family member 5,ARK5)、缝隙连接蛋白43(connexin 43,CX43)、Y盒结合蛋白-1(Y-boxbindingprotein-1,YB-1)、Grb2协同结合蛋白2(Grb2 binding protein-2,GAB2)、乙酰氨基半乳糖转移酶14(N-Acetylgalactosaminyltransferase-14,GALNT14)的表达,下调肿瘤转移蛋白基质金属肽酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)的水平,而且存在浓度的依赖性;同时抑制UHRF1的表达,并下调其调控靶分子DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase 3a,DNMT3A)和DNA甲基转移酶3B(DNA methyltransferase 3b,DNMT3B)的水平。q RT-PCR结果表明:苹果多酚可抑制UHRF1、MMP2、DNMT3A、DNMT3B、ARK5、CX43、YB-1、GAB2、GALNT14的m RNA水平,并且,m RNA的表达水平与苹果多酚的浓度呈负相关。2.苹果多酚在体内对乳腺癌裸鼠模型肿瘤生长和肿瘤血管生成的影响苹果多酚干预后,对照组和苹果多酚低剂量干预组裸鼠的体重均呈持续增加的趋势,而高剂量组裸鼠的体重则逐渐降低,其中,高剂量组与对照组和低剂量组体重变化的差异具有统计学意义。各组裸鼠肿瘤体积均有所增加,实验结束时,对照组肿瘤体积增加666%,低剂量组增加676%,而高剂量组增加728%,且高剂量组肿瘤体积最小,但各组动物肿瘤体积的差异没有统计学意义。免疫组化的结果显示:对照组和苹果多酚低剂量干预组肿瘤组织中,高分级UHRF1的阳性率均为50%,而苹果多酚高剂量干预组则为100%,但各组间的差异无统计学意义。肿瘤血管生成指标CD34的表达水平,在不同的组间存在差异,而且,与对照组相比,苹果多酚高剂量干预组CD34的表达水平显著降低,差异有统计意义。3.苹果多酚在体外对UHRF1转染的乳腺癌细胞MDA-MB-231/UHRF1增殖、迁移的影响及其作用机制台盼蓝实验结果显示:苹果多酚浓度≤100μg/ml的时候,对MDA-MB-231、MDA-MB-231/PC和MDA-MB-231/UHRF1细胞活力的抑制率差异不大,但是随着苹果多酚浓度的增加,苹果多酚对MDA-MB-231/UHRF1细胞活力的抑制率低于转染空载质粒的乳腺癌细胞MDA-MB-231/PC,由此可见,转入UHRF1的乳腺癌细胞的活力更强,但苹果多酚对其活力仍有一定的抑制作用,且该抑制作用具有浓度依赖性。CCK8实验结果显示:苹果多酚对细胞生长增殖的抑制作用随着苹果多酚浓度的增加而增大,其中,对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-231/PC细胞生长增殖的抑制率差异无统计意义,而对乳腺癌细胞MDA-MB-231/UHRF1生长增殖的抑制率最低。由此可见,UHRF1高表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231/UHRF1具有较强的生长增殖能力,但苹果多酚仍能浓度依赖性的抑制其生长增殖。划痕实验结果显示:200μg/ml的苹果多酚可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-231/PC细胞的迁移,但对MDA-MB-231/UHRF1迁移的抑制作用不显著,当苹果多酚的浓度≥400μg/ml时可有效抑制其迁移。Western blot结果显示:苹果多酚可浓度依赖性的下调MDA-MB-231/UHRF1细胞UHRF1及其调控的靶分子DNMT3B的蛋白表达水平,抑制YB-1、GAB2、CX43的表达,进而下调MMP2的水平,同时也能抑制肿瘤细胞的转移,该抑制作用与苹果多酚的浓度呈负相关。q RT-PCR结果表明:UHRF1、DNMT3B、MMP2、YB-1、GAB2、CX43的m RNA水平均随着苹果多酚浓度的增加而降低。结论:1.苹果多酚体外可通过抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231肿瘤转移相关基因(UHRF1,DNMT3a,DNMT3b,MMP2,ARK5、CX43、YB-1、GAB2、GALNT14)的m RNA和蛋白的表达水平,抑制其增殖和迁移能力,且该抑制作用存在作用时间和作用浓度的依赖性。2.苹果多酚体内可抑制乳腺癌裸鼠模型的肿瘤生长,通过下调肿瘤组织中UHRF1和CD34的表达水平抑制肿瘤的生长和转移。