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白细胞介素-12（interleukin-12,IL-12）家族是由IL-12、IL-23、IL-27、IL-35和IL-39细胞因子所组成。它们均是异源二聚体分子,其中p40是IL-12与IL-23的共用亚基。哺乳动物中的研究发现p40还能以单体或者同源二聚体（p40）2形式分泌到胞外,并介导炎症因子的产生以及自身免疫性疾病的发生,被认为是一种重要的免疫调控因子。值得注意的是,与哺乳动物中只存在一种p40编码基因不同,鱼类由于发生特异的全基因组复制现象存在多个p40旁系同源基因。目前,关于鱼类p40的研究主要集中在基因克隆和基因表达谱,而鱼类中是否存在游离形式的p40,它们蛋白水平的诱导表达特征,以及在炎症和免疫反应中的作用与及其机制等均未知。本论文以草鱼（grass carp）为模型,在证明三种草鱼p40（gcp40a,gcp40b和gcp40c）异构体能够独立分泌的基础上,分析比较它们在蛋白水平上的诱导表达特征;随后制备了三种gcp40异构体重组蛋白,探究它们调控不同细胞因子的表达及介导的信号通路;特别地,针对哺乳动物p40拮抗异源二聚体IL-12/IL-23活性的经典功能,检测gcp40异构体是否抑制IL-23的活性;除了体外实验,还通过研究皮肤创伤下gcp40异构体的作用及其机制,进一步揭示它们在鱼类的免疫调控地位和生理意义。具体研究内容包括以下方面:1.三种草鱼p40亚基的诱导表达和分泌特征:（1）以草鱼头肾白细胞（HKLs）为模型,通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测发现重组草鱼IL-1?（rgcIL-1?）、重组草鱼TNF-?（rgcTNF-?）和细菌脂多糖（LPS）能在不同时间点诱导gcp40a、gcp40b和gcp40c的mRNA表达,证明了它们能够被不同炎症因子诱导表达。（2）委托公司制备了多克隆抗体（anti-gcp40a pAb、anti-gcp40b pAb和anti-gcp40c pAb）,并验证了抗体的特异性。采用三个抗体通过免疫印迹（WB）实验检测发现在免疫刺激下gcp40a和gcp40b在胞内和胞外以单体蛋白的表达形式为主,gcp40c在胞内有异源二聚体和单体的表达形式,而在胞外以gcp40c单体形式为主,并没有检测到gcp40c二聚体形式。这些结果在蛋白层面展示了三种gcp40异构体的不同表达特征。（3）采用rgcIL-1?、rgcTNF-?和LPS处理HKLs,发现三种gcp40蛋白呈现出不同的调控作用,提示三种gcp40异构体在不同免疫反应中的地位可能不同。2.三种草鱼p40异构体重组蛋白的制备及其炎症调控性质的鉴定:（1）构建酵母表达载体并采用亲和纯化获得了高纯度的重组gcp40a,gcp40b和gcp40c蛋白（rgcp40a,rgcp40b和rgcp40c）。（2）利用酶联免疫吸附实验（ELISA）发现rgcp40a,rgcp40b和rgcp40c能刺激HKLs中促炎症因子IL-1?和TNF-?分泌,表明了三种gcp40异构体具有促炎症特性。（3）致病性嗜水气单胞杆菌感染草鱼后腹腔注射rgcp40a,苏木精-伊红（HE）染色发现rgcp40a加剧了嗜水气单胞杆菌引起的肠道固有层出血和绒毛脱落现象。（4）进一步利用anti-gcp40a pAb腹腔注射嗜水气单胞杆菌感染的草鱼,结果显示免疫中和gcp40a后能有效缓解嗜水气单胞杆菌引起的肠道出血、炎性细胞浸润和粘膜下层肿大等病理损伤。同样,利用anti-gcp40b pAb和anti-gcp40c pAb分别腹腔注射嗜水气单胞杆菌感染的草鱼,结果显示免疫中和gcp40b和gcp40c后也能有效改善嗜水气单胞杆菌引起的肠道绒毛和上皮细胞脱落以及炎性细胞浸润等病理现象。这些结果强化了三种gcp40异构体的促炎症作用。3.草鱼p40异构体调控Th17细胞标志性因子表达的研究:（1）鉴于哺乳动物p40拮抗IL-23效应的经典功能,在HKLs中检测了gcp40是否影响IL-23经典的Th17细胞效应。结果显示三种gcp40蛋白均促进重组草鱼IL-23（rgcIL-23）诱导的IL-17A/F1 mRNA表达,表明不同于它们哺乳动物同系物,gcp40能够放大IL-23的作用。相应地,WB实验表明rgcp40能够上调rgcIL-23诱导的胞内STAT3磷酸化,证实gcp40能够激活IL-23的信号通路。（2）为解释上述结果,在HKLs中检测gcp40是否直接调节Th17细胞效应分子的表达,结果发现三种gcp40异构体能单独诱导HKLs中Th17细胞标志性因子（IL-17A/F1,IL-22和IL-26）的基因表达。同时ELISA实验发现它们还能促进细胞中IL-17A/F1的分泌,首次在鱼类的研究中表明p40可作为Th17细胞的调控因子。（3）运用WB实验,相关机制研究发现rgcp40a,rgcp40b和rgcp40c能以时间依赖的方式激活STAT3、ERK和JNK的磷酸化,再通过抑制剂阻断STAT3、ERK和JNK后发现它们对IL-17A/F1的调控作用减弱,表明了三种gcp40异构体通过调控STAT3、ERK和JNK信号通路上调IL-17A/F1基因的表达。这些结果首次揭示硬骨鱼p40参与调控Th17细胞标志性因子的表达,且并非如哺乳动物同系物那样拮抗IL-23作用,展示了p40分子在鱼类免疫系统中的特色功能。4.草鱼p40在皮肤损伤修复中的功能及相关机制研究:（1）在构建的标准草鱼皮肤损伤模型中,RT-qPCR检测发现损伤处gcp40b而非gcp40a和gcp40c mRNA表达随皮肤损伤时间而发生变化,提示gcp40b可能参与损伤修复过程中。（2）进一步在嗜水气单胞菌存在下,向损伤处局部注射rgcp40b,发现gcp40b加快了细菌存在下伤口愈合的速率,证实gcp40b能够参与皮肤损伤修复过程中。（3）进一步研究gcp40b促进损伤修复的机制。RT-qPCR检测发现rgcp40b处理皮肤伤口后显著下调损伤处经典炎症因子TNF-?的基因表达,表明gcp40b能够缓解伤口炎症程度。（4）通过免疫组化（IHC）和WB实验发现,rgcp40b不加速伤口表皮处上皮细胞的增殖。同时通过体外划痕实验发现rgcp40b不改变皮肤来源的上皮细胞（EPC）迁移速率,表明gcp40b可能不参与伤口再上皮化生成。（5）但是,RT-qPCR检测发现rgcp40b能够上调伤口处的紧密连接蛋白ZO-1的表达。进一步的体外细胞通透性实验发现rgcp40b处理EPC后降低了分子的透过率,表明gcp40b促进了上皮细胞的紧密连接。（6）另外,体外将rgcp40b与嗜水气单胞杆菌体外共孵育后发现rgcp40b能够抑制嗜水气单胞杆菌的生长,表明gcp40b具有抑菌作用。在皮肤损伤模型中验证上述结果,向伤口注射rgcp40b后发现伤口处细菌的数目明显下降,证明gcp40b具有抗菌活性。这些实验结果表明gcp40b可能通过缓解了伤口炎症程度,增强了伤口屏障完整,抵抗了细菌的感染,加强了机体免疫防御功能,从而促进伤口修复。综上所述,本论文从草鱼游离p40的鉴定、诱导表达特征以及其对细胞因子的调控作用和介导的信号通路等方面的探究,阐明了硬骨鱼p40的表达特征、功能和相关作用机制。特别的是,论文发现不同于哺乳动物p40的功能,新发现gcp40能够作为Th17细胞标志性因子表达的调控因子,丰富了鱼类特有的免疫学内容。进一步,利用皮肤损伤模型,首次揭示了gcp40异构体参与皮肤损伤修复的作用与机理,反映了鱼类p40发挥免疫调节作用的生理意义,为鱼类疾病治疗提供了新思路。