橡胶生物合成中橡胶分子的延伸和终止与橡胶分子量大小密切相关,对天然橡胶质量具有重要影响,迄今尚不清楚橡胶分子延伸和终止的分子机制。本研究组在橡胶树(Hevea brisiliensis Muell.Arg.)产胶相关橡胶粒子蛋白研究中发现了只在具有橡胶生物合成活性的小橡胶粒子上表达的磷脂酶Dα1(HbPLDα1)。根据PLD酶学特性和橡胶生物合成反应的特点,我们推测HbPLDα1可能通过与其他相关橡胶粒子蛋白互作共同水解橡胶分子α-末端的磷酸二酯键,在橡胶生物合成的橡胶分子延伸和终止中发挥作用。因此,鉴定HbPLDα1的互作蛋白,构建HbPLDα1的蛋白质互作网络,探明HbPLDα1发挥功能的机制,不仅有助于阐明橡胶树橡胶产量和质量形成与调控的分子机理,而且也将为高品质橡胶树新种质创制与新品种选育提供科学依据。本研究以橡胶树(热研7-33-97,热研8-79及热垦6-28)为实验材料,构建了橡胶树均一化的cDNA文库,并利用分裂泛素化酵母双杂交系统筛选HbPLDα1的相互作用蛋白。主要研究结果如下:1.通过RT-PCR方法从橡胶树胶乳中克隆了 基因的cDNA序列。HbPLDα1基因的cDNA全长为2870 bp,开放阅读框(ORF)长度为2427 bp,HbPLDα1相对分子量约为92 kDa。2.Western blotting实验表明,HbPLDα1在橡胶树不同粒径橡胶粒子中的表达水平具有显著差异,随着橡胶粒子粒径增加,其表达水平逐渐降低。3.应用DSN方法,采用分裂泛素化酵母双杂交系统构建了均一化橡胶树胶乳cDNA文库,文库质量合格,减少了高丰度表达基因,富集了低丰度表达基因,库容量为 2.78÷106 CFU/mL,总库容量为 1.39÷107 CFU。4.以HbPLDα1为模板构建了 pBT3STE-HbPLDα1 和 pBT3SUC-HbPLDα1 诱饵表达载体,经自激活和毒性检测,选出pBT3SUC-HbPLDα1诱饵表达载体转化酵母受体NMY51。通过分裂泛素化酵母双杂交系统筛选橡胶树胶乳cDNA文库,共筛选到44个HbPLDα1候选互作蛋白,其中包括经免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)实验证明的3个橡胶粒子蛋白SRPP、REF和EF1A,点对点酵母双杂交实验进一步验证了 SRPP、REF和EFlA等蛋白与HbPLDα1具有相互作用。