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树突状细胞(Dendritic cell，DC)是目前研究所知体内功能最强大的专职抗原提呈细胞，其既能启动初始免疫应答，亦能调控免疫反应强弱，具有重要的免疫调节功能。DC-SIGN是DC表面Ⅱ型跨膜受体，属于C型凝集素受体超家族成员，由糖识别域(Carbohydrate Recognition Domain，CRD)、颈区、跨膜区和胞浆区等4个结构域组成。CRD参与识别并结合细胞或病原体表面的糖基包括:岩藻糖、Lewis糖、甘露糖等;胞浆区主要参与抗原的内吞。DC-SIGN可与T细胞表面细胞问黏附分子3（intercellular adhesion molecule3，ICAM-3）结合，参与初始T细胞的活化;亦能与血管内皮细胞上的细胞间黏附分子2(intercellular adhesion molecule2，ICAM-2)结合，介导DC的粘附与迁移。最近报道人体液（例如:血清、关节滑液和支气管肺泡灌洗液等）中存在sDC-SIGN，且在炎症刺激下其浓度显著升高，研究发现sDC-SIGN可促进CMV感染DC。鉴于膜型DC-SIGN在启动获得性免疫应答和病原体感染中的关键作用，推测sDC-SIGN亦具有重要的牛物学意义。2001年Mummidi等发现短截sDC-SIGN mRNA，但置于CHO细胞中不表达sDC-SIGN。课题组在前期工作中构建了DC-SIGN胞外段（aa61～aa404，含颈区和CRD区）原核表达载体，获得了DC-SIGN的胞外段蛋白并制备了两株单克隆抗体(4H3、1C6)。在本次研究中，我们通过制备抗DC-SIGN胞外段蛋白的多克隆抗体同时表达无融合标签的DC-SIGN胞外段蛋白，建立sDC-SIGN单多抗双夹心ELISA检测体系，通过比较健康人群和病毒感染及肿瘤患者血清中sDC-SIGN差异探索DC-SIGN的病理生理学意义，为后续研究奠定基础。本研究分为三个部分：
第一章：融合蛋白sDC-SIGN-GST的表达及其多克隆抗体的制备。本课题组前期工作将重组质粒PET41 a-sDC-SIGN转化至大肠杆菌BL21并进行表达，经抗GST柱纯化已得到融合蛋白sDC-SIGN-GST。为了得到其多克隆抗体，利用该融合蛋白免疫两只2kg左右的雌性家兔（同时设立对照），家兔经三次背部皮下多点免疫，两次静脉加强免疫后，行耳缘静脉取血1～3ml，对抗血清行间接ELISA检测两只家兔的抗血清效价均在1×106以上。此时，对家兔行颈动脉放血，4℃静置保存并于次日离心获得约150ml抗血清。选用饱和硫酸铵法对抗血清进行粗提，纯化后的多克隆抗体经蛋白定量后经SDS-PAGE和Western bolt凝胶电泳分析，证实多克隆抗体可以和融合蛋白sDC-SIGN-GST特异性结合。实验利用融合蛋白sDC-SIGN-GST，免疫家兔成功得到效价高特异性好的抗血清，为后续双夹心ELISA检测体系的建立做好准备。
第二章：PET17b-sDC-SIGN重组质粒的构建及其蛋白表达。由于以PET41a为载体表达出的融和蛋白sDC-SIGN-GST含有较大的GST标签蛋白，为了使后续对蛋白sDC-SIGN生物活性的研究更具说服力，实验中以PET17b为载体重新构建重组质粒PET17b-sDC-SIGN，并转化至大肠杆菌进行表达，以获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。以重组质粒PET41 a-sDC-SIGN为模板，PCR扩增获得sDC-SIGN目的基因，分别对产物及载体PET17b用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切后连接，未能成功，于是将PCR产物先连接至pMD18 T载体上，得到重组质粒PMD18T-sDC-SIGN，进行PCR、双酶切以及测序鉴定所插入目的基因正确后，分别对其和PET17b经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后连接，获得重组质粒PET17b-sDC-SIGN。PET17b载体上含有强启动子T7，故采用IPTG诱导表达外源蛋白。将PET17b-sDC-SIGN重组质粒转化至大肠杆菌克隆菌，挑取阳性克隆，并在大肠杆菌表达菌体中扩增，当菌量A600达到0.6-1.0时加入1mM IPTG诱导表达sDC-SIGN蛋白，希望得到可溶性表达，这样既可以省去复杂的蛋白变性和复性，重要的是蛋白如能以可溶性形式表达，其结构及活性会更接近于天然蛋白。但sDC-SIGN仍主要以包涵体形式存在。对所制备的sDC-SIGN蛋白经Western blot鉴定:分子质量在38000，且可以与本室制备的抗人DC-SIGN mAb4H3以及商品化的抗DC-SIGN mAb(DCN46)特异性结合，证明该蛋白即我们所需的目的蛋白sDC-SIGN。采用间接ELISA方法检测所表达蛋白sDC-SIGN的免疫原性:包被sDC-SIGN蛋白，检测抗体为4H3，酶标二抗为HRP-抗小鼠IgG。然sDC-SIGN蛋白与单抗结合较弱，但实验中表达了不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白，为深入研究sDC-SIGN的活性及功能奠定了基础。
第三章：sDC-SIGN单多抗双夹心ELISA检测体系的建立及初步应用。使用商品化来源于人体肾脏上皮细胞HEK293表达出的人N端胞外段DC-SIGN(Lys62～Ala404)蛋白作为夹心ELISA体系的标准品。交叉配对选用合适的抗体对，方案如下：两株单克隆抗体(4H3、1C6)和一株多克隆抗体，互为捕获抗体和检测抗体；多克隆抗体作为捕获抗体，单抗4H3、1C6以及辣根过氧化酶和生物素标记的两株单克隆抗体作为检测抗体。从14种配对方法中挑选灵敏度最高的一组。两株抗sDC-SIGN单克隆抗体与纯化兔抗sDC-SIGN多克隆抗体进行组合，确定以单克隆抗体4H3作为包被抗体，多克隆抗体作为检测抗体，相比较于其他组合可以获得更好的灵敏度。单多抗双夹心ELISA检测体系确立后，我们进一步通过对体系中包被抗体浓度、检测抗体浓度、封闭液及样品稀释液等条件予以优化。最终选用封闭液为5％的脱脂奶粉，采用PBS-1％Tween+1％BSA作为单多抗双夹心ELISA检测体系的缓冲体系，以较少体系非特异性而降低本底值。同时对体系的灵敏度、特异性、检测限及批间批内稳定性进行检测。结果表明:3个OD450点所代表的浓度值的变异系数均小于15％，表明标准曲线可重复性较好。体系批内平均变异系数6.8％，批间平均变异系数7.9％，均小于10％，说明本检测体系的可重复性较好。可以与制备的mAb4H3以及商品化DC-SIGN mAb(DNC46)结合。其体系的检测灵敏度约为5ng/ml，检测范围5-100ng/ml。应用该体系检测人可溶性DC-SIGN在健康人群、大三阳、肠癌、慢性乙型肝炎患者血清中含量，并对其分别进行两独立样本率的x2检验，统计数据显示:慢性乙型肝炎感染者与健康人群血清中sDC-SIGN含量无统计学差异(P=0.492＞0.05);与大三阳P=0.001＜0.05;与肠癌患者P=0.006＜0.05。大三阳和肠癌患者血清中sDC-SIGN与健康人有显著差异，或可提示:sDC-SIGN在疾病发生发展中存在一定的意义。